定位細(xì)胞膜上的α-,1B--腎上腺素受體以及藥物篩選模型的建立.pdf

1、本文第一章首先對細(xì)胞、分子水平藥物篩選模型以及常用的藥物篩選技術(shù)作了詳細(xì)的綜述。在細(xì)胞和分子水平上建立的高通量、高內(nèi)涵藥物篩選模型，觀察的是藥物與細(xì)胞和生物特定分子的相互作用，是目前藥物篩選的主要方法。然后對實(shí)驗(yàn)中所研究的腎上腺素受體（AR）以及實(shí)驗(yàn)中用到的激動劑和拮抗劑分別進(jìn)行了綜述。并且詳細(xì)介紹了實(shí)驗(yàn)中用到的熒光標(biāo)記物一量子點(diǎn)(QDs)的特點(diǎn)及其在藥學(xué)方面的應(yīng)用。最后對實(shí)驗(yàn)中用到的流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)、原理及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述。
　

2、　 第二章中我們使用哌唑嗪-量子點(diǎn)定位細(xì)胞表面的α1B-AR。在實(shí)驗(yàn)中采用鏈霉親和素化的QDs（QDs-streptavidin）標(biāo)記生物素化哌唑嗪（Prazosin-biotin）形成Prazosin-QDs復(fù)合物，利用拮抗劑和受體的特異性結(jié)合，用Prazosin-QDs定位HEK293α1B細(xì)胞膜上的α1B-AR，采用TIRFM獲取細(xì)胞的熒光圖像。本章實(shí)驗(yàn)對影響Prazosin-QDs定位HEK293α1B細(xì)胞膜上的α1B-AR的

3、濃度、孵育時(shí)間、溫度等多種因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，確定了定位a1B-AR的最佳條件。通過對照實(shí)驗(yàn)證明了Prazosin-QDs與α1B-AR結(jié)合的特異性，在不存在α1B-AR的HEK293細(xì)胞上的非特異性吸附較少。而且Prazosin-QDs能夠與細(xì)胞膜上的α1B-AR結(jié)合，通過圖像中熒光可以清楚的定位了細(xì)胞膜上的α1B-AR。
　　 第三章中我們對激動劑去氧腎上腺素-量子點(diǎn)標(biāo)記和示蹤α1B-AR進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)中采用鏈霉親和素

4、化的QDs（QDs-streptavidin）標(biāo)記的生物素化去氧腎上腺素(PE-biotin)，利用激動劑能和受體特異性結(jié)合，用PE-QDs來定位α1B-AR。我們對PE定位α1B-AR進(jìn)行了以下研究：
　　 1.研究了PE與生物素之間連接不同鏈長的化合物時(shí)，PE與細(xì)胞表面a1B-AR結(jié)合的情況。發(fā)現(xiàn)在biotin與PE之間的鏈越長，越易于與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，反映了細(xì)胞表面受體、配體結(jié)合時(shí)可能存在空間位阻的影響。因此，我們選擇

5、鏈最長的PE(D)作為定位α1B-AR的激動劑。
　　 2.研究了溫度對受體內(nèi)吞的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在15℃條件下，熒光點(diǎn)只分布在細(xì)胞膜，而在37℃條件下，熒光點(diǎn)分布在整個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明15℃時(shí)受體在激動劑作用下不發(fā)生內(nèi)吞，而在37℃時(shí)，受體發(fā)生內(nèi)吞。
　　 3.比較了37℃條件下激動劑和拮抗劑與α1B-AR結(jié)合后受體內(nèi)吞的差異，發(fā)現(xiàn)PE(D)-QDs作用于受體后，熒光點(diǎn)分布在整個(gè)細(xì)胞中，而Prazosin-QDs作用于

6、受體后，熒光點(diǎn)只存在于細(xì)胞表面上。
　　 4.觀測了α1B-AR的內(nèi)吞過程。我們用PE(D)-QDs定位細(xì)胞表面的受體，采用TIRFM實(shí)時(shí)觀測不同時(shí)間α1B-AR在細(xì)胞中的位置。發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的變化，α1B-AR由細(xì)胞膜逐漸被內(nèi)吞到細(xì)胞質(zhì)中。這也證明了里連接QDs的PE仍具有藥理活性。
　　 5.根據(jù)激動劑和拮抗劑與受體結(jié)合后，引起受體不同的反應(yīng)：激動劑刺激下受體向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動，而拮抗劑只是占據(jù)受體，不發(fā)生受體內(nèi)陷。我們使

7、用不同的發(fā)射波長的QDs分別標(biāo)記激動劑和拮抗劑，通過不同的通道同時(shí)觀測激動劑和拮抗劑共定位細(xì)胞上的α1B-AR。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激動劑-QDs分布在整個(gè)細(xì)胞，而拮抗劑-QDs只分布在細(xì)胞膜上。
　　 第四章中我們建立了一種基于α1B-AR藥物篩選模型。我們首先在最佳條件下，用Prazosin-QDs來標(biāo)記HEK293α1B細(xì)胞上的α1B-AR，然后通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，相對定量細(xì)胞表面Prazosin-QDs的量。在此基

8、礎(chǔ)上，我們建立了一種藥物篩選模型。在最佳條件下，使用Prazosin-QDs標(biāo)記細(xì)胞膜上的α1B-AR，此時(shí)的細(xì)胞表面的受體被Prazosin-QDs占據(jù)，然后加入待篩選的藥物與細(xì)胞表面的Prazosin-QDs競爭，再使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。通過比較待篩選藥物作用于細(xì)胞之后平均熒光強(qiáng)度的變化，來比較待篩選藥物與α1B-AR的親和力相對大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五種待篩選的拮抗劑與α1B-AR的親和力由大到小的順序是：烏拉地爾>特