滑液支原體膜表面丙酮酸脫羧酶的生物學(xué)特性研究.pdf

1、滑液支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種重要的病原微生物，其在世界各地的養(yǎng)雞場(chǎng)中均有分布，給養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重威脅。近年來的流行病學(xué)調(diào)查資料表明，滑液支原體感染呈擴(kuò)大和蔓延之勢(shì)，其危害亦日顯嚴(yán)重，甚至可能會(huì)超過雞毒支原體而成為危害養(yǎng)禽業(yè)頭號(hào)支原體病。滑液支原體主要引起雞和火雞的呼吸道感染及關(guān)節(jié)炎，而蛋雞輸卵管的損傷亦被證實(shí)與滑液支原體有關(guān)。不同的毒力株滑液支原體的感染性、組織嗜性和致病性有所不同。

2、因此，滑液支原體感染后可有不同的臨床表現(xiàn)。雖然滑液支原體的感染極少直接造成禽類的死亡，但其導(dǎo)致的生長遲滯，蛋殼畸形，死淘率上升、肉雞胴體廢棄率增加以及防控所需的大量投入，均可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而且，滑液支原體的感染可導(dǎo)致新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌等病原微生物的混合或繼發(fā)感染，從而使損失加劇。
　　目前，由于尚無有效的疫苗可供使用，滑液支原體感染的防控主要通過加強(qiáng)生產(chǎn)管理，改善飼養(yǎng)條件和合理應(yīng)用抗生素

3、等措施，但亦很難對(duì)該病完全控制和徹底清除。因此，開展滑液支原體相關(guān)的研究，必將為滑液支原體感染的有效預(yù)防和控制奠定理論基礎(chǔ)?；诖?，本研究開展了如下的研究工作:
　　1)應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對(duì)滑液支原體WUV1853株膜蛋白進(jìn)行了分離，進(jìn)而通過Western blot對(duì)膜蛋白中具有免疫原性的蛋白進(jìn)行了篩選并應(yīng)用質(zhì)譜分析的方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，所篩選的免疫原性膜蛋白分別是丙酮酸脫羧酶α亞基和β亞基、二氫硫辛酸脫氫酶PDHD、轉(zhuǎn)錄延伸因

4、子EF-Tu以及NADH氧化酶，其中丙酮酸脫羧酶α亞基和β亞基屬首次報(bào)道。
　　2)為了更有效直觀的研究滑液支原體膜蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的粘附功能，以截短的冰核蛋白InaZ基因的N-端結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定基序，構(gòu)建了用于支原體粘附相關(guān)蛋白鑒定的表面展示系統(tǒng)，并以雞毒支原體黏附素Mge2作為模型蛋白對(duì)該系統(tǒng)的展示功能進(jìn)行了驗(yàn)證。SDS-PAGE及Western blot結(jié)果顯示，融合的外源蛋白能被成功錨定到大腸桿菌的細(xì)胞外膜。免疫熒光顯微鏡和全菌

5、ELISA結(jié)果亦證實(shí)融合的外源蛋白被展示在大腸桿菌細(xì)胞的表面。表面展示有mgc2的大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附試驗(yàn)結(jié)果表明:表面展示有mgc2黏附素的大腸桿菌細(xì)胞可以粘附到DF-1細(xì)胞的表面，且這種粘附可被特異的抗體抑制。因此，研究構(gòu)建的大腸桿菌表面展示系統(tǒng)可用于支原體粘附蛋白的鑒定。
　　3)參照GenBank中滑液支原體P53株的丙酮酸脫羧酶α亞基基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增獲得滑液支原體WVU1853株丙酮酸脫羧酶α亞基并將

6、其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，測(cè)序并經(jīng)點(diǎn)突變完成密碼子優(yōu)化后，表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物PDCA純化后免疫家兔制備多抗。在此基礎(chǔ)上，完成了丙酮酸脫羧酶α亞基在滑液支原體內(nèi)的亞細(xì)胞定位、α亞基原核表達(dá)產(chǎn)物與纖維蛋白溶酶原(Plasminogen，Plg)和纖連蛋白(Finectin，F(xiàn)n)的體外結(jié)合試驗(yàn)、α亞基兔多抗介導(dǎo)的補(bǔ)體殺菌試驗(yàn)及α亞基兔多抗對(duì)滑液支原體粘附宿主細(xì)胞的抑制試驗(yàn)。結(jié)果

7、表明:丙酮酸脫羧酶α亞基在滑液支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，其原核表達(dá)產(chǎn)物具有Plg和Fn結(jié)合活性，且PDCA兔多抗能有效激活補(bǔ)體并能抑制滑液支原體對(duì)宿主細(xì)胞DF-1的黏附作用。
　　4)參照GenBank中滑液支原體P53株丙酮酸脫羧酶β亞基基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)滑液支原體WVU1853株丙酮酸脫羧酶β亞基基因pdcB進(jìn)行了擴(kuò)增，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體進(jìn)而在大腸桿菌中成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物His-PDCB純化后免疫家兔制備多抗，并以此

8、為基礎(chǔ)，分別對(duì)PDCB在滑液支原體內(nèi)的分布、其與Plg和Fn的結(jié)合活性、對(duì)宿主細(xì)胞的粘附性能進(jìn)行了分析和研究，也對(duì)His-PDCB兔多抗介導(dǎo)的補(bǔ)體殺菌試驗(yàn)和rHIS-PDCB兔多抗抑制滑液支原體粘附宿主細(xì)胞的作用進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明: PDCB在滑液支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，其原核表達(dá)產(chǎn)物His-PDCB具有結(jié)合Plg和Fn的活性，而且His-PDCB兔多抗具有明顯的介導(dǎo)補(bǔ)體殺菌作用及抑制滑液支原體對(duì)DF-1細(xì)胞粘附的作用。<

9、br>　　5)以構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET-pdcA和pET-pdcB為模板，設(shè)計(jì)引物，通過PCR和overlap-PCR擴(kuò)增出pdcA基因(A)、pdcB基因(B)及兩者的自然結(jié)構(gòu)連接A+B，并分別克隆入pETduet-1和pET-28a(+)，構(gòu)建原核共表達(dá)載體pETDuet-AB和pET-AB。共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)，經(jīng)1mM的IPTG在16℃，200rpm條件下誘導(dǎo)10h。SDS-PAGE和western bl