1型重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及對其生物學(xué)特性影響的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　 1、分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)，確保其良好的增殖能力和多向分化潛能，研究其生物學(xué)特征，并對相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為其后應(yīng)用于動物模型做準(zhǔn)備。
　　 2、制備rAAV1-EGFP載體。觀察其感染染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)及對mMSCs生物學(xué)特性的影響，并證實該病毒載體可高效轉(zhuǎn)染mMSCs并獲得高效穩(wěn)定的體外表達(dá)，以符合體內(nèi)實驗要求
　　 [方法]
　　 1、

2、沖洗小鼠長骨后，I型膠原酶消化長骨碎片，PBS洗凈骨片后完全培養(yǎng)基接種骨片。靜置3天，換液去除骨碎片及未貼壁細(xì)胞。后每3天換液。細(xì)胞融合度達(dá)70％-80%胰酶消化，按4×103/cm2密度接種培養(yǎng)。觀察mMSCs生長特點、表面特異性標(biāo)記、多向分化潛能的變化情況。
　　 2、采用PEI轉(zhuǎn)染法將三質(zhì)粒pTR-EGFP，pXR-1，PXX680共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝rAAV1-EGFP，通過氯化銫密度梯度離心純化獲得rAAV1-EG

3、FP;通過實時定量PCR檢測病毒滴度。
　　 3、采用不同滴度rAAV1-EGFP感染MSCs，需找合適的感染復(fù)數(shù)。觀察轉(zhuǎn)染后mMSCs生長特點、表面特異性標(biāo)記、多向分化潛能的變化情況。觀察rAAV1-EGFP轉(zhuǎn)染對于mMSCs生物學(xué)特性的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、收集小鼠骨片培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)3代以上后細(xì)胞呈現(xiàn)為均質(zhì)性較好的短梭形細(xì)胞。細(xì)胞匯合80%-90%時G0/G1期細(xì)胞百分率83.77%。P3-P6

4、代細(xì)胞表面抗原高表達(dá)CD29、CD44、Sca-1，低表達(dá)CD45、CD31、CD34;P4代細(xì)胞經(jīng)體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，可分化為成骨及脂肪細(xì)胞，證實所培養(yǎng)細(xì)胞具備多向分化潛能。
　　 2、通過實時定量PCR檢測，獲得高純度的滴度為1.4×1011vg/ml的rAAV1-EGFP。
　　 3、rAAV1-EGFP感染mMSCs最合適MOI值為105。流式細(xì)胞儀檢測rAAV1-EGFP感染mMSCs48hGFP.的表達(dá)率為97

5、.5%±0.5%。rAAV1-EGFP感染mMSCs后，mMSCs可正常貼壁，生長迅速，形態(tài)上無明顯改變，其細(xì)胞表面特異性標(biāo)記及多向分化潛能未受明顯影響。
　　 [結(jié)論]
　　 1、通過骨片法成功分離、培養(yǎng)了正常C57BL/6小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，生物學(xué)特性穩(wěn)定，可用于進(jìn)行動物實驗。
　　 2、成功構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒載體，并證實對其對mMSCs具有較高的轉(zhuǎn)染效率并獲得高效穩(wěn)定的體外表達(dá)，rAAV1轉(zhuǎn)染未明顯影