Notch3對(duì)心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　心肌纖維化(MF)是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變,也是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一。心肌成纖維細(xì)胞(CFs)占心臟間質(zhì)細(xì)胞的90％。在心肌受損后的結(jié)構(gòu)代償中,CFs增殖及分化,分泌膠原,參與組織修復(fù)。然而進(jìn)行性發(fā)展的心肌纖維化將引起心室重構(gòu),導(dǎo)致心臟功能障礙。在心肌纖維化過(guò)程中,CFs分化為肌成纖維細(xì)胞(MFs)是其中一個(gè)重要機(jī)制。
　　Notch是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞組織分化密切相關(guān)的信號(hào)通路分子。No

2、tch受體有4個(gè)亞型(Notchl-4),它們通過(guò)與鄰近細(xì)胞間的相互作用來(lái)精確調(diào)控各譜系細(xì)胞的分化及各器官的病理生理過(guò)程,但其調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。近年來(lái)一些研究報(bào)道,Notch信號(hào)通路參與許多纖維化疾病,然而在心肌纖維化中的研究尚未開(kāi)展。
　　研究目的:
　　1.CFs向MFs轉(zhuǎn)化時(shí),Notch3表達(dá)量是否發(fā)生變化?
　　2.Notch3表達(dá)抑制后,能否促進(jìn)CFs向MFs轉(zhuǎn)化?
　　3.Notch3表達(dá)上調(diào)后,

3、能否抑制CFs向MFs轉(zhuǎn)化?
　　研究方法:
　　1.用膠原酶和胰酶混合消化法分離培養(yǎng)原代SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h后,將其分別于含0,1,2,5,10ng/ml5個(gè)不同濃度的TGF-β1培養(yǎng)液誘導(dǎo)24h,用Western blot檢測(cè)CFs中平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),用免疫熒光法檢測(cè)α-SMA在CFs中的表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞上清羥脯氨酸含量;用Real Time PCR及Western blot檢測(cè)Notch3 mRNA及

4、蛋白的表達(dá)變化。
　　2.用原代培養(yǎng)的SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h后,用RNAi法干擾CFs中Notch3的表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為3組:即空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組,siRNA干擾組。72h后,用Real Time PCR及Western blot檢測(cè)干擾效果,Western blot檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)量,用免疫熒光法檢測(cè)α-SMA在CFs中的表達(dá)情況,檢測(cè)各組細(xì)胞上清羥脯氨酸含量。
　　3.用原代培養(yǎng)的SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h

5、后,利用構(gòu)建的過(guò)表達(dá)Notch3慢病毒轉(zhuǎn)染CFs,實(shí)驗(yàn)分為5組:即空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組,Notch3過(guò)表達(dá)組,TGF-β1誘導(dǎo)組,TGF-β1誘導(dǎo)+Notch3過(guò)表達(dá)組。72h后,用Real Time PCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,Western blot檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)量,用免疫熒光法檢測(cè)α-SMA在CFs中的表達(dá)情況,檢測(cè)各組細(xì)胞上清羥脯氨酸含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.采用膠原酶和胰酶混合消化

6、法,成功分離培養(yǎng)SD仔鼠CFs。使用含10%胎牛血清低糖DMEM正常培養(yǎng)24h,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)多樣,為多突的紡錘形或星型的扁平細(xì)胞,無(wú)自發(fā)搏動(dòng),核呈卵圓形、居中。
　　2.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無(wú)血清低糖DMEM同步化培養(yǎng)24h,再用含0,1,2,5,10ng/ml5個(gè)不同濃度的TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。檢測(cè)各組CFs細(xì)胞細(xì)胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達(dá)量隨TGF-β1濃度升高而增加,Notc

7、h3 mRNA及蛋白表達(dá)量隨TGF-β1濃度升高而降低。其中2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml3個(gè)濃度組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示TGF-β1能濃度依賴增加CFs向MFs轉(zhuǎn)化,同時(shí)抑制Notch3表達(dá)。
　　3.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無(wú)血清低糖DMEM同步化培養(yǎng)24h,再使用Notch3的siRNA對(duì)CFs進(jìn)行干擾,與對(duì)照組相比,干擾組Notch3 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.05),同時(shí),干擾

8、組細(xì)胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達(dá)增加(P<0.05)。提示Notch3表達(dá)下調(diào)后,CFs向MFs轉(zhuǎn)化增加。
　　4.利用不同滴度陰性對(duì)照病毒對(duì)CFs轉(zhuǎn)染,當(dāng)復(fù)感染指數(shù)(MOI)為20,轉(zhuǎn)染72h時(shí),熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率大約80%左右。因此,本實(shí)驗(yàn)以MOI=20進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。
　　5.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無(wú)血清低糖DMEM同步化24h,再使用過(guò)表達(dá)Notch3慢病毒轉(zhuǎn)染,同時(shí)加入10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)1

9、2h組及10ng/mlTGF-β1誘導(dǎo)24h后再轉(zhuǎn)染Notch3組,與空白對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組Notch3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),細(xì)胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達(dá)減少(P<0.05),TGF-β1誘導(dǎo)組Notch3蛋白表達(dá)均下降(P<0.05),細(xì)胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達(dá)升高(P<0.05),而與對(duì)照組相比,TGF-β1+Notch3組無(wú)明顯差異。該結(jié)果提示過(guò)表達(dá)Notch3后,能抑制CFs向MFs轉(zhuǎn)