神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及缺血過程中磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的演變.pdf

1、第一部分磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在大鼠神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中的表達(dá)
　　 目的：細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育及衰老過程中神經(jīng)元上存在著細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的廣泛表達(dá)，提示細(xì)胞周期相關(guān)蛋白具有調(diào)控細(xì)胞分裂之外的功能。而細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的磷酸化在細(xì)胞周期調(diào)控中起著非常關(guān)鍵的作用，CDKs的磷酸化代表細(xì)胞周期的激活和細(xì)胞周期各時(shí)相之間的轉(zhuǎn)換，但目前為止尚無磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中表達(dá)的報(bào)道。

2、為此，我們設(shè)計(jì)了本部分實(shí)驗(yàn)，研究磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在大鼠神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中的表達(dá)。
　　 方法：選取正常生理狀態(tài)下的不同發(fā)育階段的大鼠作為研究對象，分別選取出生后1天(PN1d)、出生后11天(PN11d)、出生后1月(PN1m)、出生后3月(PN3m)、出生后15月(PN15m)的大鼠進(jìn)行對比，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測各年齡階段的大鼠皮層及海馬神經(jīng)元中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達(dá)，同時(shí)分離海馬，提取總蛋

3、白，運(yùn)用Western-blot檢測海馬中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的蛋白含量。
　　 結(jié)果：(1)免疫熒光顯示NeuN 染色陽性所代表的神經(jīng)元的數(shù)量隨著年齡的增加而逐漸減少；(2)免疫熒光染色中皮層及海馬神經(jīng)元中陽性表達(dá)的磷酸化CDK2、磷酸化Rb 隨著年齡的增加而增加，在老年階段陽性率顯著增加；(3)Western-blot檢測提示隨著年齡的增加磷酸化CDK2、磷酸化Rb的蛋白含量逐漸增加；(4)磷酸化CDC

4、2在各年齡階段的免疫熒光染色中均無陽性表達(dá)，Western-blot 中顯示各年齡階段中磷酸化CDC2的蛋白含量均較低，且各組間無顯著性差異。
　　 結(jié)論：大鼠發(fā)育尤其是衰老時(shí)神經(jīng)元的磷酸化CDK2、磷酸化Rb 陽性表達(dá)增多提示部分神經(jīng)元細(xì)胞周期再次被激活，進(jìn)入細(xì)胞周期的神經(jīng)元并未通過G2/M 調(diào)控點(diǎn)，而走向凋亡，提示細(xì)胞周期機(jī)制可能參與了衰老神經(jīng)元凋亡過程的調(diào)控。
　　 第二部分磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在局灶性腦缺血后神

5、經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：局灶性腦缺血后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞對于缺血的反應(yīng)不同，缺血導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡，而星形膠質(zhì)細(xì)胞卻明顯增生。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期機(jī)制參與了腦缺血后神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，但目前的研究多集中在缺血后Cyclins和CDKI的表達(dá)上，尚無實(shí)驗(yàn)顯示CDKs在腦缺血后神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)中的作用，而CDKs是細(xì)胞周期調(diào)控的核心機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的目的就是為了明確CDKs在腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)并對

6、比其在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的差異，以深入探討腦缺血損傷反應(yīng)的細(xì)胞周期機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用正常Wistar大鼠，參照Nagasawa 方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)測定缺血灶周邊神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)缺血后缺血中心區(qū)大部分神經(jīng)元死亡，而缺血周邊區(qū)神經(jīng)元形態(tài)多不規(guī)則；(2)正常對照組神經(jīng)元中僅見少量磷酸化CDK2、磷

7、酸化Rb的表達(dá)，而缺血后24h 磷酸化CDK2、磷酸化Rb的表達(dá)明顯增加，持續(xù)至缺血后3d，缺血后7d 至14d 時(shí)表達(dá)量與正常對照組無顯著性差異，磷酸化CDC2在正常對照組及缺血后各組間均無表達(dá)；(3)缺血后膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，在缺血后3d 膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)達(dá)到高峰；(4)正常對照組中星形膠質(zhì)細(xì)胞的磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb 僅有極少量表達(dá)，而缺血后24h 出現(xiàn)表達(dá)增加，在缺血后3d 表達(dá)量最多，缺血后7d 表達(dá)量下降，

8、而缺血后14d 星形膠質(zhì)細(xì)胞中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達(dá)恢復(fù)至正常水平。
　　 結(jié)論：局灶性腦缺血后缺血灶周邊神經(jīng)元中磷酸化CDK2、磷酸化Rb的表達(dá)提示部分神經(jīng)元再次激活細(xì)胞周期，但未通過細(xì)胞周期G2/M 期控制點(diǎn)，提示再次進(jìn)入細(xì)胞周期的神經(jīng)元并未完成整個(gè)細(xì)胞周期，而可能走向凋亡；而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，局灶性腦缺血后早期細(xì)胞周期被激活，代表G1/S 期的細(xì)胞周期蛋白磷酸化CDK2、磷酸化Rb和代表G2/M