黃芩苷對大鼠腦缺血再灌注損傷后凝血酶毒性損傷的干預(yù)研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦血管病CVD(Cerebrovascular disease)是當(dāng)今社會嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，在全球已成為第一致殘和第三致死的病因，而缺血性CVD的發(fā)病率約在CVD發(fā)病率的75％。其早期的治療是在窗口期內(nèi)進行溶栓，恢復(fù)缺血區(qū)及周圍組織的血液供應(yīng)，使腦組織重新得到氧的供應(yīng)和某些神經(jīng)元的可逆性損傷及時獲得功能上的恢復(fù)，然而復(fù)流后其功能未能得到有效的恢復(fù)，而進一步加重腦水腫和神經(jīng)元壞死與凋亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的

2、腦機能障礙，此稱為腦缺血再灌注損傷CIRI(Cerebral Ischemia Reperfusion Injury)。近年來的研究表明，CIRI演變過程中貫穿的病因病機相對較為復(fù)雜，在眾多的病因中凝血酶神經(jīng)毒性損傷占據(jù)了非常重要的位置，特別是隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)各種凝血酶受體的發(fā)現(xiàn)，但其神經(jīng)損傷機制及應(yīng)用凝血酶抑制劑進行保護機制尚未完全闡明。本次研究利用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性缺血再灌注模型，從中醫(yī)“熱毒學(xué)”角度出發(fā)，應(yīng)用具有清熱

3、解毒功效的黃芩主要提取物黃芩苷對CIRI后凝血酶毒性神經(jīng)損傷機制進行干預(yù)研究，證實黃芩苷對CIRI后凝血酶神經(jīng)毒性損傷具有保護作用，給臨床治療CIRI提供了新的實驗依據(jù)和治療靶點，為中醫(yī)藥治療CIRI提供新的思路和方法。
　　 研究目的：
　　 通過線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性CIRI模型，觀察黃芩苷在不同治療時間點內(nèi)不同劑量對大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響、腦組織的病理形態(tài)學(xué)改變、缺血組織PAR-1的蛋白表達(dá)水平、NF-

4、кBp65和Caspase-3陽性細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的檢測，探討黃芩苷對CIRI后凝血酶毒性損傷和神經(jīng)元保護的機制。
　　 研究方法：
　　 1.大鼠局灶性CIRI模型的制備:Wistar雄性青年大鼠，SPF級，體重280-320g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為:假手術(shù)組、模型組、黃芩苷小、中、大劑量組(25、50、100mg/kg)、阿加曲班對照組，每組15只。利用特制的線栓進行制備大鼠局灶性大腦中動脈腦缺血再灌注模型，在缺血3h

5、后實現(xiàn)再灌注，治療組和對照組術(shù)后立即腹腔分別注射不同劑量的黃芩苷混懸液和阿加曲班注射液，余組等量生理鹽水，每天一次。
　　 2.于術(shù)后3h、1、3、7天進行腦神經(jīng)功能缺損評分、在1、3、7天取缺血腦組織固定和冰凍。
　　 3.通過常規(guī)HE染色法觀察缺血腦組織的病理結(jié)構(gòu)改變。
　　 4.Westernblot法觀察缺血組織的PAR-1的蛋白表達(dá)水平。
　　 5.分別用免疫組織化學(xué)法觀察NF-кBp65和Ca

6、spase-3的陽性細(xì)胞表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.觀察各組大鼠神經(jīng)功能5分制評分結(jié)果:假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組神經(jīng)功能評分明顯升高，與模型組相比，治療組不同劑量、不同時間點神經(jīng)功能評分明顯降低，用藥7天大劑量組明顯優(yōu)于缺血3h組，幾乎無神經(jīng)缺損癥狀，活動自如，飲食正常，與對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.HE染色后顯微鏡觀察缺血腦組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變:假手術(shù)海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正

7、常，著色均勻。模型組的海馬區(qū)、紋狀體有小灶性的缺血區(qū)域，部分蛻變的神經(jīng)元呈凋亡的特征，治療組雖見神經(jīng)元排列紊亂，但程度輕，部分神經(jīng)元恢復(fù)基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，以大劑量7天組改善最為明顯，神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)良好。
　　 3.Western blot法觀察PAR-1結(jié)果:假手術(shù)組大腦PAR-1蛋白表達(dá)維持低水平，且相對穩(wěn)定，模型組PAR-1明顯升高，治療組的PAR-1蛋白表達(dá)隨著劑量的升高和治療時間的延長蛋白水平明顯下降，大劑量7天組表達(dá)水平接

8、近假手術(shù)組。
　　 4.免疫組化觀察NF-кBp65陽性細(xì)胞表達(dá):假手術(shù)組未見明顯的陽性細(xì)胞表達(dá)，模型組可見陽性細(xì)胞分布集中在缺血中心區(qū)域，神經(jīng)元可見皺縮和腫大、扭曲變形等多種形態(tài)，治療大劑量組7天可見形態(tài)接近正常的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。
　　 5.免疫組化觀察Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá):假手術(shù)組未見凋亡細(xì)胞，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，模型組發(fā)現(xiàn)有大量凋亡細(xì)胞和凋亡小體分布在皮層及紋狀體區(qū)，胞核與胞漿著色變深，治療組胞漿著色變淺