產(chǎn)DCase的基因工程菌發(fā)酵及酶固定化工藝研究.pdf

1、本實驗菌種spMF0507是產(chǎn)DHase和DCase的野生菌，而DHase活力遠遠大于DCase，因此可以通過控制適當pH值，使DCase失活，而保留DHase活力生產(chǎn)NC-D-pHPG。此外還有一菌種Espf7是克隆了DCase基因的大腸桿菌，它能表達DCase活性繼續(xù)將NC-D-pHPG轉(zhuǎn)化為D-pHPG，可DCase是胞內(nèi)酶，故需要對其進行細胞破碎才能釋放出酶。另外利用正交法對spMF0507的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵培養(yǎng)條件也進行了研究

2、，之后把發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果投入5升發(fā)酵罐進行驗證。最后對工程菌Espf7發(fā)酵后提取的酶進行了固定化研究，通過測定蛋白質(zhì)含量和酶活力來確定固定化結(jié)果。以下是整個實驗結(jié)果： (1)菌種spMF0507的適宜接種齡是20～24h，pH值控制在9.0～9.5時，可以使DCase失活，DHase活力仍有0.2u·mL-1，在該條件下來制備NC-D-pHPG。但轉(zhuǎn)化過程中，NC-D-pHPG容易被氧化成紅色物質(zhì)，而通氮氣能防止其被氧化。提取NC-

3、D-pHPG時加入2％的丙酮能加快結(jié)晶速度，結(jié)晶率達到97.9％，NC-D-pHPG的純度達98.5％。 (2)基因工程菌Espf7在0.02％的氯仿用量下可以通透細胞膜，適宜接種齡為16～20h，接種量2％，初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度30℃，阿拉伯糖0.01％；甘油0.30％；玉米漿3％；NaCL0.2％；KH2PO40.05％；MgSO40.05％；MnCL20.02％；CoCL20.01％，使DCase活力由1.12u·m

4、L-1提高到2.1u·mL-1，提高了87.5％。在發(fā)酵罐上控制條件溫度30℃、轉(zhuǎn)速500r/min，pH設定在7.0來補料，結(jié)果活力提高到3u·mL-1。 (3)均質(zhì)機破碎細胞的最佳條件為：壓力控制在70MPa，破碎時間15min。以TJS環(huán)氧基樹脂作為固定載體，最適固定化條件為：TJS用量1g對應133u酶活，固定時間15h，溫度28℃，pH值7.5最后固定化酶活為58u·g-1，蛋白固定率可達98％，酶活回收率達到49.3