堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、結(jié)締組織生長因子在腰椎肥厚黃韌帶中的表達及作用研究.pdf

1、目的：
　　 對纖維化相關(guān)細胞因子堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白表達量在肥厚與非肥厚腰椎黃韌帶中的表達進行檢測，探討其在腰椎黃韌帶肥厚過程中的作用，并在此基礎(chǔ)上進行黃韌帶細胞培養(yǎng)，加入相關(guān)細胞因子進行干預(yù)，檢測干預(yù)后膠原蛋白的mRNA及產(chǎn)物進行檢測，對組織實驗的結(jié)果進行印證并探索黃韌帶肥厚的機制。
　　 背景：
　　 腰椎管狹窄

2、癥的主要病理改變之一是黃韌帶肥厚，但其病理機制還不是很清楚，在力學(xué)上，可能是因為椎間盤退變后的不穩(wěn)造成。目前的研究認(rèn)為黃韌帶肥厚可能是由于椎間不穩(wěn)使黃韌帶受牽拉，出現(xiàn)不斷的微損傷后持續(xù)的纖維化介導(dǎo)的疤痕組織積聚的結(jié)果。但黃韌帶肥厚的相關(guān)分子機制并不清楚，這也是臨床上對于腰椎黃韌帶肥厚所引起的腰椎管狹窄患者缺少藥物等保守治療手段的原因。有研究發(fā)現(xiàn)，腰椎黃韌帶細胞進行培養(yǎng)后牽拉后TGF-β1分泌增加，而TGF-β1是公認(rèn)最強的促纖維化的細胞

3、因子。TGF-β1可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的平衡而促進其纖維化增生；然而也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃韌帶肥厚程度增加，TGF-β表達反而減少，皮膚瘢痕的研究中也發(fā)現(xiàn)TGF-β只在疤痕形成早期表達，在肥厚的疤痕愈合后TGF-β表達明顯減少或停止表達，因此考慮TGF-β可能在黃韌帶肥厚形成早期發(fā)揮作用，介導(dǎo)膠原纖維的合成增加，而在黃韌帶持續(xù)纖維化中，則可能還有其他的促膠原纖維合成的生長因子或細胞因子

4、參與。炎癥相關(guān)因子如COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-1α、IL-8、IL-6等也可能參與調(diào)節(jié)纖維化過程。在皮膚瘢痕形成研究中發(fā)現(xiàn)，單一應(yīng)用任何的細胞生長因子都不能使成纖維細胞持續(xù)的纖維化，多個細胞生長因子共同作用是持續(xù)纖維化所必須的，TGF-β可能在介導(dǎo)纖維組織和肉芽組織形成中起作用，而bFGF和CTGF對維持細胞纖維化起重要作用，雖然bFBF、CTGF和TGF-β1在皮膚瘢痕愈合中的作用有了深入的研究，但在黃韌帶中的作用還未

5、見相關(guān)報道。黃韌帶肥厚與皮膚瘢痕形成的關(guān)鍵細胞都是成纖維細胞，所以本研究認(rèn)為，在黃韌帶纖維化肥厚的過程中，bFBF、TGF-β1和CTGF可能有相似的作用。
　　 方法：
　　 本研究分為兩個部分：組織實驗和細胞實驗。組織實驗分三個組：對照組6例、腰椎黃韌帶肥厚組6例、突出組(單純腰椎間盤突出癥患者)6例，分別作為正常黃韌帶、黃韌帶肥厚晚期和早期。對各組黃韌帶中bFGF、TGF-β1、CTGF及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的mRN

6、A含量用實時定量RT-PCR的方法進行檢測，用Western Blot法檢測bFGF、TGF-β1、CTGF產(chǎn)物在各組黃韌帶中的表達，對三個細胞因子在黃韌帶肥厚過程中的作用進行探討。細胞實驗采用年輕患者非肥厚的黃韌帶進行培養(yǎng)，分成三個大組加入不同濃度的bFGF、TGF-β1，培養(yǎng)24小時后對細胞檢測膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的mRNA含量，用培養(yǎng)液以Elisa法檢測膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ產(chǎn)物的表達。
　　 結(jié)果：
　　 腰椎黃韌帶組

7、織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，bFGF mRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達均明顯高于突出組和對照組(P<0.05，P<0.05)，在突出組中的表達稍低于對照組，但兩組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CTGF mRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達均值雖稍高，但三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；TGF-β1 mRNA在三組中的表達與bFGF相似，在狹窄組中的表達明顯高于對照組(P<0.01)，也高于突出組(P<0.01)，在突出組和對照組之間沒有差異(P

8、>0.05)。Western blot檢測三者產(chǎn)物在黃韌帶中的表達也發(fā)現(xiàn)β-actin顯影良好，bFGF、TGF-β1在腰椎管狹窄組中均有明顯表達，且多于對照組。多次重復(fù)實驗均未獲得CTGF的顯影條帶；COLⅠmRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達均明顯高于對照組和突出組(P<0.05，P<0.05)，在突出組中的表達稍高于對照組，但兩組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；COLⅢ、ⅤmRNA在三組中的表達均值雖有變化，但三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異

9、(P>0.05)。細胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，加入TGF-β1時，COLⅠmRNA表達量隨濃度的增加而增加；加入bFGF時，COLⅠmRNA表達量隨濃度的增加而降低，但加入最低濃度時較對照組明顯表達增加，說明黃韌帶細胞在bGFG低濃度時表達是增加的，而稍高濃度后則抑制COLⅠmRNA的表達；同時加入bFGF、TGF-β1時，COLⅠmRNA的表達仍基本是個增加的趨勢，在最高濃度時表達最高，說明TGF-β1對COLⅠmRNA的影響占主導(dǎo)作用。統(tǒng)計結(jié)果

10、發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGF-β1、bFGF對COLⅠmRNA表達有顯著意義(p<0.01)；
　　 2)兩個因素有交互作用；
　　 3)兩個因素中TGF-β1占主要作用。
　　 加入TGF-β1時，COLⅢ mRNA在低濃度是隨濃度而增加，在TGF-β1濃度為1ng/ml時表達最多，增加濃度則表達量反而下降；加入bFGF時，COLⅢ mRNA的表達在低濃度是隨濃度而增加，10ng/ml時表達最高，而后增加b

11、FGF濃度則表達量逐漸下降；同時加入bFGF、TGF-β1時，COLⅢ mRNA的表達在bFGF為10ng/ml、TGF-β1為0.1ng/ml時表達最高，降低或升高濃度則表達下降，說明bFGF對COLⅢ mRNA的作用占主導(dǎo)因素。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGFb1、bFGF對ColAⅢ mRNA表達有顯著意義(p<0.01)；
　　 2)兩個因素沒有有交互作用；
　　 3)兩個因素中bFGF占主要作用。

12、>　　 細胞培養(yǎng)液檢測各型膠原蛋白產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：加入TGF-β1時，COLⅠ表達量先降低，而后隨濃度的增加而增加，當(dāng)TGF-β1濃度為1ng/ml時表達最高，說明該細胞因子對COLⅠ的表達有明顯的影響；加入bFGF時，COLⅠ表達量隨濃度的增加基本是個增加的趨勢，但高濃度時變化不大，說明黃韌帶細胞在高濃度下COLⅠ表達有影響，但在低濃度是影響明顯；同時加入bFGF、TGF-β1時，COLⅠ的表達先升高，而后維持相同的水平。統(tǒng)計結(jié)果表明：<

13、br>　　 1)bFGF、bFGF對COLⅠ表達有顯著意義，(p<0.01)；
　　 2)兩個因素沒有交互作用；
　　 3)兩個因素中bFGF占主要作用。
　　 加入TGF-β1時，COLⅢ在低濃度是隨濃度而增加，在TGF-β1濃度為0.1ng/ml時表達最多，增加濃度則表達量反而下降；加入bFGF時，COLⅢ的表達與對照組沒有明顯區(qū)別；同時加入bFGF、TGF-β1時，COLⅢ mRNA的表達在bFGF為10

14、ng/ml、TGF-β1為0.1ng/ml時表達最高，降低或升高濃度則表達下降。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGF-β1對COLⅢ有顯著意義(p<0.01)，bFGF對COLⅢ無顯著意義(p>0.05)；
　　 2)兩個因素沒有交互作用。
　　 分別加入TGF-β1、bFGF或同時加入bFGF、TGF-β1時，COLⅤ的表達均沒有明顯的變化，各組間沒有差異。統(tǒng)計結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：TGFb1、bFGF對COLⅤ無顯著意義(

15、p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究第一部分組織實驗利用定量PCR方法檢測各組黃韌帶中bFGF、CTGF、TGF-β1 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)bFGF、TGF-β1 mRNA在黃韌帶肥厚組中表達明顯高于突出組和對照組，且Westren blot法檢測三細胞因子產(chǎn)物的表達也發(fā)現(xiàn)二者在肥厚的黃韌帶中表達增高，說明bFGF、TGF-β1在腰椎黃韌帶肥厚形成過程中有重要作用；定量PCR法檢測COLⅠ、Ⅲ、Ⅴ mRNA發(fā)

16、現(xiàn)前二者在肥厚黃韌帶中表達明顯增高，但COLⅤ mRNA在三組中的表達沒有差異，表明引起黃韌帶肥厚的主要膠原產(chǎn)物為COLⅠ、Ⅲ。
　　 2、第二部分細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，分別加入不同濃度的bFGF、或二者同時加入時，表達有明顯增高或降低，加入TGF-β1時表達隨濃度增高而增高，加入bFGF時COLⅠmRNA表達在低濃度是增高，而后隨濃度增高表達降低，二因子對COLⅠmRNA的表達有交互作用且以TGF-β1為主；加入TGF-β1時COL

17、Ⅲ mRNA表達隨濃度增高而有增高趨勢，但不明顯，加入bFGF時COLⅢ mRNA表達先逐漸增高，而后隨濃度增高表達降低，二因子對COLⅢ mRNA的表達沒有交互作用，以bFGF對COLⅢ mRNA的影響為主；而COLⅤmRNA在各組細胞中沒有明顯表達。Elisa法檢測細胞液中COLⅠ、Ⅲ、Ⅴ三者產(chǎn)物的表達發(fā)現(xiàn)，二因子對COLⅠ、Ⅲ的表達均有影響，但前者以bFGF影響為主，而后者以TGF-β1影響為主，COLⅤ在各組細胞中均有表達，但與