HSV-2感染ECV304細胞的生物學效應研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)嚴重威脅人類健康，雖然大量的流行病學資料顯示傳統(tǒng)的危險因子是動脈粥樣硬化的主要危險因素，但動脈粥樣硬化仍然有許多潛在的病因亟待探索。研究表明，病原微生物感染可能參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，感染后的炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。有關病毒感染與AS的關系逐漸受到人們重視，血清流行病學和分子生物學的研究資料表明，HSV及其DNA序列存在于AS的病灶組織，主要見于血管平滑肌細胞(SMC)和內皮細胞(EC)

2、，且AS患者血清HSV的抗體陽性率明顯增高，提示HSV的感染在AS的形成和發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用。迄今為止，對于HSV如何參與AS的發(fā)病機制尚缺乏深入的了解，病毒對體外靶細胞的作用可以反映病毒對體內細胞的直接作用，研究體外情況下HSV感染血管內皮細胞的生物學效應，對闡明HSV的致病機制具有非常重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，HSV可通過內皮毒性作用、損害內皮依賴的舒張功能及影響內皮粘附功能等方式造成內皮結構和功能損傷，但其潛在的基因水平

3、的機制尚不清楚。傳統(tǒng)的RNA方法學如Northern斑點雜交分析一次只能研究一種基因，成本高，效率低，而新興的基因芯片技術，提供了一種基因差異表達的高通量研究工具。本實驗應用基因芯片技術研究了HSV-2對人臍靜脈內皮樣細胞(ECV-304)基因表達的影響，以探討HSV導致血管內皮損傷和動脈粥樣硬化的基因機制。 基于以上設想，擬主要觀測：①感染細胞形態(tài)變化；②病毒核酸代謝、病毒抗原表達；③感染細胞基因表達方面的變化。探討以上內容的

4、變化特點和規(guī)律，在細胞和分子水平上闡述HSV致血管內皮細胞的生物學效應，為進一步揭示HSV的致病機制及其治療和預防提供一定的理論基礎。 方法： 1.采用HSV-2感染體外培養(yǎng)的ECV-304細胞，建立HSV的細胞感染模型。 2.對于ECV-304細胞的感染模型，主要運用相差顯微鏡和電子顯微鏡觀察感染細胞的形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀測病毒抗原的表達，噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖的變化，流式細胞儀測定HSV感染后的

5、細胞凋亡狀況。 3.在細胞感染早期，應用人全基因組寡核苷酸表達譜芯片篩選差異表達的基因，并利用生物學信息的手段分析這些差異基因所參與的生物過程。 4.選擇2個上調基因(SP100基因和RPS24基因)和2個下調基因(RTP801基因和HNRPA1基因)應用實時定量PCR加以驗證，比較實時定量PCR和基因表達譜芯片二種檢測方法所得結果的相關性。 5.各項指標以均數(shù)±標準差表示，兩組均值間比較用單向方差分析(One-

6、wayANOVA)檢驗，統(tǒng)計學處理均在計算機上用SPSS10.0軟件完成。P＜0.05表示有顯著性差異。 主要結果： 1.病毒抗原表達變化：HSV-2感染ECV-304細胞后，細胞胞漿內出現(xiàn)片狀或顆粒性黃綠色熒光，說明ECV-304細胞內存在HSV-2病毒抗原表達。 2.細胞增殖變化：HSV-2感染ECV-304細胞后12h和24h，細胞的抑制率分別為18.6％和47.2％，統(tǒng)計學分析表明，病毒在不同時相對同一株

7、細胞的抑制率均存在顯著性差異。 3.感染細胞形態(tài)變化：HSV-2感染ECV-304細胞后12h，出現(xiàn)灶性細胞病變，主要為細胞逐漸變圓、變大，核變大、核膜移位，折光性差。接種后24h病變范圍呈片狀擴大，融合成多核巨細胞，染色體著邊、核破碎。48h大部分細胞脫落、多核巨細胞裂解。電鏡結果顯示，感染后12h，ECV304細胞出現(xiàn)細胞融合，典型的核染色質濃集，分布與核膜周邊，形成花瓣形核，內質網增多，繞核周分布，且出現(xiàn)大而明顯的空泡，空

8、泡內有少量未成熟的病毒粒子。感染后24h，ECV304細胞出現(xiàn)多核巨細胞，線粒體內嵴紊亂、斷裂，出現(xiàn)不同程度的自噬化、溶酶體化、空泡化，并可見到大量“鷹眼樣”的已包裝成熟的病毒顆粒以及正在包裝的病毒粒子。 4.細胞凋亡檢測：經瓊脂糖凝膠電泳分析，HSV-2感染ECV-304細胞后對照組及感染組均未見典型的細胞DNA降解梯狀條帶。經流式細胞儀檢測，對照組及感染組均未出現(xiàn)G1峰左側的亞二倍體細胞群峰型(亞G1峰，也稱凋亡峰)，提示H

9、SV-2感染ECV304細胞后未發(fā)生凋亡現(xiàn)象。 5.基因芯片檢測：通過對HSV-2感染ECV-304細胞后6h的對照組及感染組基因表達譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)，每張芯片共有18775個數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)，其中共有462個基因存在顯著性表達差異，與對照組相比在實驗組中有318個基因發(fā)生了上調表達變化，144個基因發(fā)生了下調表達變化。主要包括與細胞粘附、信號傳遞、細胞分裂、DNA復制、細胞周期、炎性反應、凋亡、離子通道、細胞受體、免疫和代謝等相關

10、的基因。 6.通過生物信息學分析差異基因所參與的生物過程，結果發(fā)現(xiàn)462條差異基因共參與了237個生物過程，其中有79個生物過程具有顯著性差異(P＜0.05)。主要包括蛋白質合成、信號傳遞、蛋白質折疊、RNA剪接、離子通道、核糖體的合成和組裝、細胞呼吸、DNA和mRNA代謝等生物過程。與蛋白質合成相關的RPS10、RPS20、EEF1B2、SUI1等73個基因普遍上調，WBSCR1、GARS、PARS、RPL6等7個基因普遍下調

11、；與蛋白質伸展和折疊相關的HSPA8、HSPE1、CCT2等8個基因上調，HSPCB、HSPCA、CCT3等9個基因下調；與細胞信號轉導相關的RPS27、CASK、APP、HINT1等12個基因上調，SCGB1A1、RHO、CELSR1等5個基因下調。 7.實時定量PCR結果：HSV-2感染ECV304細胞6h時通過實時定量PCR檢測，可以看出SP100基因和RPS24基因處理組比對照組分別升高2.187和1.733倍，這與基因

12、芯片檢測結果(分別為2.097和2.980)基本一致，說明在HSV-2感染ECV304的過程中SP100基因和RPS24基因的表達顯著升高。RTP801基因處理組比對照組降低0.211倍，與基因芯片檢測結果(0.3263)基本一致，提示在HSV-2感染ECV304的過程中RTP801基因的表達顯著降低。HNRPA1基因處理組比對照組升高1.633倍，而基因芯片檢測結果為降低0.380，二者結果不一致，需要進一步驗證。 結論：

13、 1.HSV-2可感染體外培養(yǎng)的ECV304細胞并導致ECV304細胞出現(xiàn)典型的細胞病變，主要引起細胞發(fā)生融合性和裂解性變化，未發(fā)現(xiàn)HSV-2對ECV304細胞的誘導凋亡現(xiàn)象。 2.應用基因芯片技術研究了HSV-2對ECV304細胞基因表達的影響，共發(fā)現(xiàn)462條差異表達的基因，其中表達上調的基因318條，表達下調的基因144條。主要包括與細胞粘附、信號傳遞、細胞分裂、DNA復制、細胞周期、炎性反應、凋亡、離子通道、細胞受體、

14、免疫和代謝等相關的基因。 3.通過生物信息學分析差異基因所參與的生物過程，結果發(fā)現(xiàn)462條差異基因共參與了237個生物過程，其中有79個生物過程具有顯著性差異(P＜0.05)。主要包括蛋白質合成、信號傳遞、蛋白質折疊、RNA剪接、離子通道、核糖體的合成和組裝、細胞呼吸、DNA和mRNA代謝等生物過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在這些差異基因中有多種基因可能參與了HSV致內皮損傷、宮頸癌及動脈粥樣硬化，而其它多數(shù)首次發(fā)現(xiàn)的差異表達的基因在H

15、SV致病機制中的作用尚不清楚。盡管如此，通過基因芯片篩選異常表達的基因，為深入研究HSV導致內皮損傷和動脈粥樣硬化的機制提供了有價值的線索。 4.應用雙鏈DNA結合SYBRGreenⅠ的實時定量PCR驗證差異基因，定量結果與基因芯片檢測結果基本一致，說明了人全基因組寡核苷酸表達譜芯片在篩選差異表達基因中具有的可靠性。 通過對HSV-2感染ECV304細胞的生物學效應研究，初步發(fā)現(xiàn)了在早期感染過程中的大量差異表達基因，為進