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文檔簡(jiǎn)介
1、背景和目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B vires,HBV)感染是一全球性的公共健康問(wèn)題,我國(guó)是乙型肝炎高流行國(guó)家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者往往遷延不愈,常由肝炎發(fā)展為肝硬化,甚至肝癌,在此過(guò)程中機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。研究證明,乙肝慢性化的重要機(jī)制之一是HBV抗原特異性T細(xì)胞免疫耐受,患者不能產(chǎn)生針對(duì)HBV特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxJc T lymphocyt
2、e,CTL)免疫反應(yīng),所以不能清除體內(nèi)病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)缺陷,不能把病毒抗原的信號(hào)有效傳遞給機(jī)體免疫系統(tǒng)。因此,恢復(fù)DC數(shù)量或加強(qiáng)DC抗原遞呈功能,充分激活機(jī)體免疫反應(yīng)已成為治療CHB的重要途徑之一。 DC是能激活初始化T淋巴細(xì)胞的重要抗原遞呈細(xì)胞,在抗病毒細(xì)胞免疫中起重要作用。通過(guò)粒細(xì)胞.巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4
3、)體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增可以獲得足夠的外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC(monocyte-derived DC,MoDC)。CD1a主要表達(dá)于人胸腺細(xì)胞和DC,是人DC相對(duì)特征性標(biāo)志,CD83是成熟DC的重要標(biāo)記,CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。 干擾素α(interferon-α,IFN-α)和核苷(酸)類(lèi)似物是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的慢性乙肝抗病毒治療藥。IFN-α除直接抑制HBV復(fù)制外,通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)}tBV的免疫力也是一重要的途徑
4、,其機(jī)制較復(fù)雜;恩替卡韋(entecavir,ETV)是一新型口服核苷類(lèi)藥物,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后,與脫氧胞嘧啶核苷(dCTP)競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入病毒合成中的DNA鏈,終止病毒DNA的復(fù)制。胸腺肽α1可增強(qiáng)非特異性免疫功能,多用于聯(lián)合治療CHB。但這些藥物對(duì)于CHB患者DC的影響,文獻(xiàn)報(bào)道較少,尤其是ETV作為目前臨床上最強(qiáng)的CHB抗病毒藥,對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分別與CHB的外周血MoDC體外共孵育
5、,通過(guò)測(cè)定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表達(dá),檢測(cè)DC培養(yǎng)液中IL-6、IL-12含量和同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等一系列指標(biāo)觀察它們對(duì)CHB的DC生物學(xué)特性的影響,為臨床上應(yīng)用以上藥物及其與DC疫苗相結(jié)合治療CHB尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 采集CHB患者及健康人外周新鮮靜脈血以肝素抗凝后通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體外密度梯度離心分離獲得單個(gè)核細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸
6、單個(gè)核細(xì)胞后接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板靜置2小時(shí),輕輕洗脫未貼壁懸浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/mlrhIL-4)誘導(dǎo)擴(kuò)增,37℃、5%CO<,2>飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天半量換液。第5天收集DC,將CHB來(lái)源DC分別加入一定濃度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分為IFN-α組、胸腺肽α1組、E
7、TV組和IFN-α+胸腺肽α1組,同時(shí)設(shè)健康對(duì)照組和CHB對(duì)照組,繼續(xù)共培養(yǎng),第8天收獲各組DC進(jìn)行以下相關(guān)檢測(cè): 1.倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2.流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表達(dá)。 3.同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)法測(cè)定DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力。 4.ELISA法檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-6含量。 結(jié)果 1.培養(yǎng)第8d
8、觀察各組細(xì)胞,健康對(duì)照組培養(yǎng)液中漂浮著較多云霧狀的DC細(xì)胞團(tuán),表面突起豐富;各藥物處理組均可見(jiàn)表面突起豐富的DC;CHB對(duì)照組DC多呈不規(guī)則形、多角形;健康對(duì)照組和各CHB藥物處理組細(xì)胞分化形態(tài)優(yōu)于CHB對(duì)照組。 2.培養(yǎng)第8d的各組DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表達(dá),在健康對(duì)照組明顯高于CHB對(duì)照組和各CHB藥物處理組(P<0.05);CHB對(duì)照組低于各CHB藥物處理組(P<0.05);IFN-α+胸腺肽α1
9、組、IFN-α組和胸腺肽α1組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05),但均高于ETV組(P<0.05)。 3.健康對(duì)照組DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng);CHB對(duì)照組DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力最弱;各CHB藥物處理組強(qiáng)于CHB對(duì)照組;IFN-α+胸腺肽α1組、IFN-α組和胸腺肽α1組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05),但均高于ETV組(.P<0.05)。 4.各組DC培養(yǎng)上清液中IL-12含量為健康對(duì)照組最高,其次為各C
10、HB藥物處理組,CHB對(duì)照組最低(P<0.05);IL-6含量與之相反(P<0.05)。 結(jié)論 1.采用rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)的方法可以成功地從外周血單核細(xì)胞中體外誘導(dǎo)分化成DC,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供足量的細(xì)胞。 2.CHB的DC與健康人相比其分化較差,膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表達(dá)降低,刺激淋巴細(xì)胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下,提示其功能缺陷,可能是HBV慢性感染
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