人源抗-CTGF單鏈抗體的制備及其在抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化中作用的研究.pdf

1、背景：結(jié)締組織生長因子(CTGF)可以促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，是導致肺纖維化的關(guān)鍵因子。阻斷CTGF可能是治療肺纖維化的有效方法。
　　目的：制備抗結(jié)締組織生長因子單鏈抗體(scFv)，研究其住抑制肺纖維化形成和發(fā)展中的作用，探索其對肺成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的影響以及可能的信號通路，初步闡明其作用機制。
　　方法：使用定點突變試劑盒將前期構(gòu)建的質(zhì)粒pET32a-TrxA-His-scFv-His突變?yōu)閜ET32a-TrxA-

2、scFv-His并將之轉(zhuǎn)化到E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導表達融合蛋白TrxA-scFv-His，經(jīng)過凝血酶酶切及兩次鎳柱親和層析得到抗CTGF單鏈抗體蛋白，SDS-PAGE電泳檢測其純度，ELISA檢驗其免疫學活性。使用TGF-β1與制備的scFv共同干預(yù)人胚肺成纖維細胞，通過RT-PCR、免疫熒光實驗及Western Blot技術(shù)檢測各組人胚腫成纖維細胞中的α-SMA的表達水平。Western Blot檢

3、測scFv對HELF的D-Akt的影響。
　　結(jié)果：SDS-PAGE電泳顯示經(jīng)過親和層析得到的抗CTGF單鏈抗體純度在95％以上，ELISA實驗表明抗其能夠CTGF特異性結(jié)合，RT-PCR、Western Blot及免疫熒光實驗顯示TGF-β1對人胚肺成纖維細胞的α-SMA上調(diào)表達作用能夠被抗CTGF單鏈抗體所抑制。Western Blot結(jié)果顯示抗CTGF單鏈抗體可抑制人胚肺成纖維細胞的Akt的磷酸化。
　　結(jié)論：我們制備