人工設(shè)計的干擾性LncRNAi競爭性消耗Onco-miRNAs發(fā)揮抗肝癌療效的實驗研究.pdf

1、[研究背景和目的]
　　近來生物信息學(xué)分析表明，人類相當(dāng)數(shù)量的基因受microRNAs(miRNAs)的調(diào)控，miRNAs在多種生物的生命進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用。與正常組織相比，腫瘤組織中的miRNAs表達(dá)譜發(fā)生變化，說明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNAs密切相關(guān)。在腫瘤組織中，miRNAs充當(dāng)著致癌性或抑癌性的角色，調(diào)控其靶基因的表達(dá)和功能，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。其中腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的致癌性miRNAs(Oncogenic miRNAs

2、，OncomiRs)會滅活一些抑癌基因。因此針對這些高表達(dá)的致癌性miRNAs的靶向治療價值不可估量。
　　目前，以miRNAs為靶點的腫瘤治療方案很多，其中有采用miRNAs抑制劑或反義序列封閉miRNAs的表達(dá)。但現(xiàn)有的治療大多針對單一的miRNA或其家族。由于miRNAs調(diào)控機制復(fù)雜，一個miRNA可能調(diào)控多個靶基因，而一個靶基因也可能受多個miRNAs調(diào)控，因此針對單一miRNA表達(dá)的干預(yù)對腫瘤的抑制效果很有限。設(shè)想在細(xì)胞

3、內(nèi)引入一條人工設(shè)計的干擾性長鏈非編碼RNA(Interfering long non-coding RNA，LncRNAi)，該LncRNAi同時包含能與多個OncomiRs種子序列互補結(jié)合的序列，能夠與OncomiRs的靶基因mRNAs競爭結(jié)合OncomiRs，從而消耗細(xì)胞內(nèi)高水平的OncomiRs，對OncomiRs的抑癌性靶基因起保護(hù)作用。但是，這樣的競爭性保護(hù)作用，需要競爭者（即LncRNAi）的拷貝數(shù)要明顯高于被競爭者（即On

4、comiRs）才能顯現(xiàn)良好的效果。本研究利用前期構(gòu)建并在實驗中證實能夠在肝癌中高拷貝增殖的溶瘤腺病毒載體，表達(dá)一種人工合成的LncRNAi。隨腺病毒在癌細(xì)胞中復(fù)制，實現(xiàn)LncRNAi在癌細(xì)胞中的大量表達(dá)，競爭性消耗OncomiRs，從而實現(xiàn)對癌細(xì)胞的靶向干預(yù)治療。
　　[研究方法]
　　1、腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定:以前期構(gòu)建的Survivin啟動子調(diào)控的腫瘤特異性增殖腺病毒AdSurp為載體，將12個在肝癌中高表達(dá)的Onco

5、miRs種子序列的互補序列（表1）串聯(lián)起來并重復(fù)6個拷貝數(shù)后，作為編碼LncRNAi的基因序列，構(gòu)建表達(dá)LncRNAi的腫瘤特異性增殖腺病毒AdSVPE1a-lncR。同時構(gòu)建以綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)代替E1a的攜帶LncRNAi的非增殖型陽性對照腺病毒AdSVPeGFP-lncR，并以前期構(gòu)建的Ad5-EGFP為陰性對照腺病毒。
　　2、細(xì)胞系培養(yǎng):肝癌細(xì)胞系(HepG2、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97H

6、、MHCC97L、Huh-7、PLC/PRF/5)和正常肝細(xì)胞系(L02、WRL-68)來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞與生化研究所細(xì)胞庫，按供應(yīng)商提供的方法培養(yǎng)。
　　3、基因表達(dá)檢測:上述細(xì)胞系感染不同強度的實驗腺病毒和對照腺病毒，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
　　4、腺病毒特異性增殖活性的檢測:上述細(xì)胞系以MOI=1pfu/cell感染AdSVPE1a-lncR，以AdSV

7、PeGFP-lncR為對照，分別在0h、24h、48h、72h時間點收集細(xì)胞，TCID50方法檢測病毒滴度。
　　5、腺病毒介導(dǎo)的LncRNAi表達(dá)檢測:上述細(xì)胞系以MOI=1 pfu/cell感染AdSVPE1a-lncR，以AdSVPeGFP-lncR為對照，常規(guī)RT-PCR以及實時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測LncRNAi的表達(dá)。
　　6、細(xì)胞增殖活性檢測:通過四唑鹽比色實驗（MTT法）檢測病毒AdSVPE1

8、a-lncR對肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞增殖的影響，以AdSVPeGFP-lncR和Ad5-EGFP為對照。
　　7、遷移與侵襲實驗:上述細(xì)胞系以MOI=1 pfu/cell感染AdSVPE1a-lncR，以AdSVPeGFP-lncR和Ad5-eGFP為病毒對照組，另設(shè)不加病毒的親代細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對照，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移侵襲能力。
　　8、細(xì)胞周期和凋亡:上述細(xì)胞系以MOI=1pfu/cell感染AdSVPE

9、1a-lncR，以AdSVPeGFP-lncR和Ad5-eGFP為病毒對照組，另設(shè)不加病毒的親代細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對照，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。
　　9、細(xì)胞蛋白表達(dá)譜變化的檢測:Huh-7細(xì)胞以MOI=1 pfu/cell的感染強度感染AdSVPE1 a-lncR，設(shè)Ad5-eGFP為陰性病毒對照，不加病毒的細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對照。48h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，基因表達(dá)譜芯片檢測蛋白表達(dá)的變化。
　　1

10、0、動物模型實驗:構(gòu)建小鼠肝癌移植瘤模型，實驗病毒干預(yù)治療后，觀察記錄腫瘤生長情況。
　　[研究結(jié)果]
　　1、腫瘤特異性增殖腺病毒在肝癌細(xì)胞中特異性增殖:本實驗構(gòu)建的表達(dá)LncRNAi的腫瘤特異性增殖腺病毒AdSVPE1a-lncR，以腫瘤高特異性的Survivin啟動子調(diào)控E1a表達(dá)，實現(xiàn)病毒的靶向特異性增殖。細(xì)胞感染AdSVPE1a-lncR后，Westem Blot檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為不同程度的Survivin陽性

11、表達(dá)，而正常肝細(xì)胞WRL-68、L02為Survivin陰性表達(dá)。腺病毒E1a在肝癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)程度與Survivin表達(dá)水平相一致，AdSVPE1a-lncR在部分Survivin高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中特異性增殖復(fù)制的能力非常強，最高達(dá)68465.66倍(Huh-7)，而在正常細(xì)胞L02、WRL-68中增殖不明顯。
　　2、腫瘤特異性增殖腺病毒在肝癌細(xì)胞中介導(dǎo)LncRNAi的表達(dá):AdSVPE1a-lncR介導(dǎo)的LncRNAi表

12、達(dá)，qRT-PCR檢測顯示，AdSVPE1a-lncR介導(dǎo)的LncRNAi表達(dá)水平，在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞。
　　3、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi對肝癌細(xì)胞增殖活性有抑制作用: AdSVPE1a-lncR對Hep3B和Huh-7殺傷活性最強，Hep3B存活率在MOI=0.5pfu/cell時已下降到50％以下，在MOI=2pfu/cell時已下降到10％以下;Huh-7存活率在MOI=1pfu/cell

13、時已下降到50％以下，在MOI=100pfu/cell時已下降到10％以下。AdSVPE1a-lncR對其他肝癌細(xì)胞的殺傷也較強，而對正常肝細(xì)胞生物增殖無明顯影響。
　　4、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi對肝癌細(xì)胞運動能力有抑制作用:Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗顯示，與空白對照組相比，AdSVPE1 a-lncR對部分肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力有較強的抑制作用，其作用明顯強于非增殖的對照腺病毒AdSVPeGFP-lnc

14、R。AdSVPE1a-lncR和AdSVPeGFP-lncR對正常肝細(xì)胞的運動能力無明顯抑制作用。
　　5、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi誘導(dǎo)細(xì)胞周期的變化:實驗腺病毒AdSVPE1a-lncR和對照腺病毒AdSVPeGFP-lncR、Ad5-EGFP對正常肝細(xì)胞周期各時相無明顯作用，而對于肝癌細(xì)胞，AdSVPE1a-lncR對細(xì)胞周期時相的變化因細(xì)胞不同而不同。PLC/PRF/5、Hep3B、Huh-7細(xì)胞表現(xiàn)為G0/G

15、1期阻滯，而HepG2、MHCC97H細(xì)胞表現(xiàn)為S期阻滯。
　　6、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡:本組實驗細(xì)胞在感染AdSVPE1a-lncR后，均表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡比例的升高，以Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5、Huh-7細(xì)胞凋亡比例的升高最為明顯，而BEL-7402、WRL-68和L02細(xì)胞凋亡比例的升高無統(tǒng)計差異。實驗細(xì)胞感染非增殖型對照腺病毒AdSVPeGFP-lncR后，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活

16、性較弱。
　　7、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi影響細(xì)胞蛋白的表達(dá)譜:Huh-7和HepG2細(xì)胞感染AdSVPE1a-lncR后，基因表達(dá)譜變化明顯。檢出708個基因表達(dá)升高，以抑癌基因表達(dá)升高為主(PTEN、p27kipl、TIMP3、RECK);檢出628個基因表達(dá)降低，以原癌基因表達(dá)降低為主(p38/MAPK、Survivin、CDK4、c-myc)。
　　8、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)LncRNAi對肝癌細(xì)胞裸

17、鼠移植瘤有生長抑制作用:肝癌細(xì)胞Huh-7裸鼠移植瘤成瘤后， AdSVPE1a-lncR治療組腫瘤生長速度明顯低于空白對照組，治療第42天AdSVPE1a-lncR組瘤體體積明顯低于治療前;AdSVPeGFP-lncR治療組在治療后28天后也較空白對照組也出現(xiàn)一定程度的生長抑制，差別具有顯著意義，但瘤體仍在持續(xù)增長中;Ad5-EGFP組自始至終未出現(xiàn)生長抑制。
　　[研究結(jié)論]
　　以前期構(gòu)建、并在實驗中得到有效性驗證的Su

18、rvivin啟動子調(diào)控的腫瘤特異性增殖腺病毒為載體，表達(dá)一種人工設(shè)計合成的干擾性長鏈非編碼RNA(LncRNAi)，該LncRNAi包含一組（12個）能夠通過多種機制促進(jìn)HCC癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的OncomiRs的種子序列的互補結(jié)合序列，包括miR-21、miR-221/222、miR-224、miR-17-5p、miR-10b、miR106b、 miR-151-5p、miR-155、miR-181a/181b、miR-184、miR-1、

19、miR-501。腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)的LncRNAi表達(dá)，可以競爭性消耗OncomiRs，廣泛抑制OncomiRs相關(guān)的多條信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮更有效的抗癌效應(yīng)。這種方法克服了單一miRNA干預(yù)腫瘤抑制效果有限、癌細(xì)胞通過旁路信號途徑重新獲得增殖活力的缺陷。以Survivin啟動子調(diào)控腺病毒僅在Survivin陽性的肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性增殖，釋放子代病毒殺傷更多的腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無影響。同時其介導(dǎo)表達(dá)的LncRNAi只對Oncomi