鴨瘟病毒gC基因介導(dǎo)的宿主細(xì)胞吸附特性及gC--TK-雙基因缺失株構(gòu)建.pdf

1、鴨瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病對(duì)鴨、鵝、天鵝等造成的高發(fā)病率和高死亡率特征使其嚴(yán)重危害水禽業(yè)發(fā)展。本研究工作目的在于明確鴨瘟病毒(DPV)gC基因介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞的吸附特性，以及構(gòu)建鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失病毒株。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的吸附感染宿主細(xì)胞特性研究
　　通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組鴨瘟病毒gC缺失株(DPV-ΔgC-EGFP)與親本株(DPV-CHv)對(duì)鴨胚成纖維

2、細(xì)胞(DEF)吸附能力的差異及細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素(HS)在其中的作用，探討鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的吸附感染宿主細(xì)胞的特性。
　　首先，建立基于EGFP基因定量PCR檢測(cè)DPV-ΔgC-EGFP和基于gC基因定量PCR檢測(cè)DPV-CHv病毒DNA拷貝數(shù)的方法，檢測(cè)病毒在DEF不同吸附時(shí)間和吸附1h后不同增殖時(shí)間病毒DNA拷貝數(shù)的差異，分析gC基因?qū)Σ《疚降挠绊?。結(jié)果DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)病毒吸附量增加

3、且于90 min時(shí)病毒吸附含量達(dá)峰值而穩(wěn)定，各時(shí)間點(diǎn)DPV-CHv吸附細(xì)胞的病毒量均高于DPV-ΔgC-EGFP，吸附90 min后兩種病毒含量差異不顯著，但吸附60 min時(shí)DPV-CHv病毒量極顯著高于DPV-ΔgC-EGFP;吸附1h后DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv均隨增殖時(shí)間的延長(zhǎng)病毒含量增加，增殖74 h以?xún)?nèi)的各時(shí)間點(diǎn)病毒含量差異不顯著，但增殖74 h時(shí)DPV-CHv的病毒含量顯著高于DPV-ΔgC-EGFP，表明g

4、C與DPV吸附有關(guān)且主要在病毒吸附前期發(fā)揮作用。
　　然后，將DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv的病毒與不同濃度的肝素(Heparin)于37℃作用1h再接種DEF細(xì)胞及將不同濃度的肝素酶37℃1h處理DEF細(xì)胞后再將病毒接種DEF細(xì)胞，定量PCR檢測(cè)DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv吸附感染DEF細(xì)胞病毒DNA拷貝數(shù)的變化。結(jié)果無(wú)論是Heparin與病毒作用后還是肝素酶處理細(xì)胞后DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CH

5、v病毒吸附感染DEF細(xì)胞的病毒量均并無(wú)顯著性差異，表明肝素抑制病毒結(jié)合細(xì)胞表面HS以及肝素酶降解細(xì)胞表面HS后均不影響gC缺失株和親本株病毒對(duì)DEF細(xì)胞的吸附感染，即DPV不依賴(lài)于HS吸附到DEF細(xì)胞。
　　同時(shí)利用肝素層析柱HiTrap Heparin HP對(duì)透析復(fù)性的原核表達(dá)DPV-gC重組蛋白進(jìn)行親和層析，并設(shè)置原核表達(dá)的DPV-gB重組蛋白作陽(yáng)性對(duì)照、原核表達(dá)的DPV-gE重組蛋白作陰性對(duì)照，以SDS-PAGE以及west

6、ern blot檢測(cè)各重組蛋白與HS的特異性結(jié)合力。結(jié)果表明DPV-gB能特異性結(jié)合HS，而DPV-gC與DPV-gE不能特異性與HS結(jié)合。綜上表明，DPV gC不是通過(guò)與細(xì)胞表面HS結(jié)合而介導(dǎo)病毒吸附，且gC影響病毒的吸附主要在前期發(fā)揮作用，對(duì)病毒后期吸附的總量并無(wú)影響。
　　2.鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失株構(gòu)建及部分生長(zhǎng)特性
　　根據(jù)gC和TK基因是皰疹病毒復(fù)制非必需基因且與病毒毒力有關(guān)，在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的TK缺失

7、的細(xì)菌人工染色體重組鴨瘟病毒DPV CHv-BAC-G的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)Red重組技術(shù)構(gòu)建DPV gC-/TK-雙基因缺失株DPV CHv-BAC-GΔgC及其gC回復(fù)突變株DPV CHv-BAC-GΔgCR，PCR、RFLP和IFA鑒定結(jié)果表明，成功獲得鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失株及其gC回復(fù)突變病毒株。測(cè)定DPV CHv-BAC-GΔgC與DPVCHv-BAC-GΔgCR的部分體外生長(zhǎng)特性，將病毒感染DEF細(xì)胞，用0

8、.5％甲基纖維素固定病毒蝕斑的大小和形狀并用0.5％結(jié)晶紫染色，觀察比較蝕斑大小，結(jié)果CHv-BAC-G和CHv-BAC-GΔgCR感染宿主細(xì)胞DEF后形成的空斑大小接近、形態(tài)相似，但CHv-BAC-GΔgC形成的空斑顯著減小，表明gC可影響病毒空斑的大小。將等量病毒DNA拷貝數(shù)的CHv-BAC-G、CHv-BAC-GΔgC和CHv-BAC-GΔgCR分別接種到DEF細(xì)胞，定量PCR方法檢測(cè)接種后0～120 h不同增殖時(shí)間細(xì)胞和上清中的