弓形蟲病分子診斷方法及弓形蟲分離株耐藥性的研究.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的以孕婦(畜)流產、弱胎、畸胎、死胎和兒童(幼畜)生長受阻、死亡等為特征的人畜共患病。該病廣泛存在于世界各地，宿主范圍十分廣泛，人及大多數動物感染率都較高，是人類優(yōu)生的大敵，是當今新生兒致畸的四大病因之一。弓形蟲病在豬場感染率高，嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。建立準確快速的診斷方法和研制安全高效疫苗是預防和控制弓形蟲病的重要措施。MIC3是弓形蟲在速殖

2、子、緩殖子及子孢子期都表達的粘附蛋白，與弓形蟲入侵宿主細胞密切相關，已證明其具有良好的免疫原性。本研究利用原核表達的弓形蟲微線體蛋白3(MIC3)建立了SPA-ELISA和AG-ELISA檢測方法，利用細胞培養(yǎng)方法從臨床血清學陽性的病料中分離得到了10株弓形蟲蟲株，并對蟲株的耐藥性進行了研究。主要研究成果如下： 本研究利用本室構建的pGEX-KG-MIC3質粒轉化感受態(tài)細胞，確定了pGEX-KG-MIC3在E.coliBL21-

3、CodonPlus菌株中高效表達的最佳條件，SDS-PAGE實驗表明表達的融合蛋白分子量為66KD，表達產物經Westernblot檢測證實具有較強的免疫反應原性。 利用純化的重組蛋白rMIC3替代傳統的蟲體成份作為診斷抗原建立了SPA-ELISA和AG-ELISA診斷方法。這兩種方法檢測豬其它常見病原體陽性血清，結果全為陰性；SPA-ELISA和AG-ELISA分別能檢測到1:6400和1:12800稀釋血清中的抗T.gond

4、ii特異性抗體；診斷試劑的批內(間)重復試驗，ELISA變異系數<10％；在4℃貯存下診斷試劑的保質期均超過8個月。結果表明，本研究建立的兩種診斷方法均具有良好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性及較長的保質期。 為驗證和比較SPA-ELISA和AG-ELISA的廣適性，在臨床上，檢測了四種不同動物血清，共332份，并與MAT方法進行了比較，結果表明，除山羊血清外，SPA-ELISA對豬、犬、貓血清的陽性檢出率均高于MAT方法，二者符合率超

5、過90％。利用AG-ELISA檢測四種動物血清，共304份，并與MAT方法進行比較，結果顯示，AG-ELISA對四種動物血清的陽性檢出率均高于MAT方法。說明了AG-ELISA具有更廣泛的宿主適用范圍。 為進一步驗證AG-ELISA的實際應用效果，利用已建立的AG-ELISA監(jiān)測了人工感染弓形蟲豬體內抗體水平的動態(tài)變化，同時用MAT方法及ELISAkit平行測定。結果表明，首次感染第10d，8頭人工感染豬的AG-ELISA抗體均

6、為陽性，第35d，AG-ELISA抗體水平達到高峰，隨后緩慢下降，在第57d時仍可檢測到ELISA抗體。Kappa一致性試驗結果表明，AG-ELISA與MAT方法及ELISAkit符合良好。 為提高弓形蟲細胞分離的陽性率，對細胞培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，結果顯示，細胞培養(yǎng)的最佳條件為選用DMEM高糖培養(yǎng)基，加入1％血清和10％SRC。采集豬的抗凝全血，利用細胞培養(yǎng)方法進行了弓形蟲蟲株的分離。利用上述培養(yǎng)條件，對19份弓形蟲AG-ELI

7、SA抗體陽性的抗凝血進行了弓形蟲蟲株的分離培養(yǎng)，經顯微鏡觀察、PCR檢測以及動物接種試驗證明，成功地分離得到10株弓形蟲分離株。耐藥性試驗初步顯示其中的一株對磺胺類藥物具有一定的抗藥性。 本研究建立的SPA-ELISA和AG-ELISA診斷方法，解決了目前弓形蟲病不易快速、準確、簡便診斷的難題，對多種動物弓形蟲病的臨床診斷、疾病控制等均具有重要意義。豬源弓形蟲蟲株的分離及磺胺耐藥現象的初步證實，為弓形蟲病的有效防治及合理用藥奠定