不結(jié)球白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的初步研究.pdf

1、不結(jié)球白菜(Brassic campestris L.ssp.Chinensis(L.)Makino)原產(chǎn)中國(guó)，屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種蔬菜，是一種重要的葉菜類蔬菜。不結(jié)球白菜種質(zhì)資源極其豐富，不僅數(shù)量多，而且類型復(fù)雜。然而隨著生產(chǎn)中少數(shù)高產(chǎn)品種的大面積栽培，使許多地方品種和農(nóng)家品種被淘汰，品種單一化和遺傳脆弱化日趨嚴(yán)重。利用分子標(biāo)記進(jìn)行不結(jié)球白菜資源鑒定和分類對(duì)不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育具有重要意義。為進(jìn)一步挖掘不結(jié)球白菜遺

2、傳潛力，拓寬遺傳基礎(chǔ)，充分利用種質(zhì)資源，本研究從分子水平分析了不結(jié)球白菜資源的遺傳多樣性。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合成功設(shè)計(jì)并優(yōu)化了不結(jié)球白菜的ISSR．和SRAP技術(shù)體系。利用ISSR、RAPD和SRAP三種標(biāo)記技術(shù)對(duì)96份不結(jié)球白菜資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，采用Jaccard方法計(jì)算出遺傳相似系數(shù)矩陣，以UPGMA法對(duì)96份不結(jié)球白菜資源進(jìn)行了聚類分析，并分析了不結(jié)球白菜種群間的遺傳分化。利用ISSR．RAPD和SRAP技術(shù)對(duì)2

3、個(gè)不結(jié)球白菜組合的雙親和F1進(jìn)行了引物篩選，初步建立了應(yīng)用于不結(jié)球白菜親本及其F1的指紋圖譜。研究主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和Mg2+4種因素在不結(jié)球白菜ISSR、SRAP反應(yīng)體系中的適宜濃度范圍，并在此基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從4種因素3個(gè)水平對(duì)不結(jié)球白菜ISSR、SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確立了適合不結(jié)球白菜的ISSR、SRAP反應(yīng)體系。在20μL的ISSR反應(yīng)體系中，含T

4、aq DNA聚合酶1U、dNTP 0.25mmol/L、引物0.25gmol/L、1×PCR buffer、Mgz2+ 2.5mmol/L、模板DNA30ng。在20μl的SRAP反應(yīng)體系中，含raq DNA聚合酶1U、dNTP 0.15mmol/L、正向引物0.35μmol/L、反向引物0.351xmol/L、Mg2+3.5mmol/L。通過(guò)梯度PCR測(cè)驗(yàn)和總循環(huán)次數(shù)梯度處理，確定了適宜的ISSR反應(yīng)總循環(huán)數(shù)和ISSR．引物UBC82

5、2的退火溫度。使用優(yōu)化后的反應(yīng)體系能夠?qū)?種主要的蕓薹屬作物進(jìn)行有效的鑒別。優(yōu)化體系的建立為今后利用ISSR、SRAP技術(shù)進(jìn)行不結(jié)球白菜種質(zhì)資源分類、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 2.利用ISSR、RAPD和SRAP三種標(biāo)記對(duì)96份不結(jié)球白菜資源的DNA遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，SRAP在三種標(biāo)記中多態(tài)性最高，RAPD次之，ISSR較低，11個(gè)SRAP引物組合、14條RAPD引物和15條ISSR引物分別檢測(cè)出3

6、46、98和185個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)分別為293、71和127個(gè)，PPB分別達(dá)84.68％、72.45％和68.65％；不結(jié)球白菜各類型中以普通白菜的Shannon信息指數(shù)最高，其中又以秋冬栽培類型最高，是遺傳多樣性最豐富的類型。聚類結(jié)果顯示，各變種類型不能被明顯地分開(kāi)，在RAPD標(biāo)記聚類結(jié)果中尤為明顯?？傮w上菜薹資源與普通白菜遺傳距離較近，而普通白菜中的香青菜比較特殊，多數(shù)聚類到一起并同其它普通白菜區(qū)分開(kāi)：對(duì)不結(jié)球白菜種群遺傳多樣

7、性的分析顯示，不結(jié)球白菜的遺傳分化系數(shù)較低，大部分變異主要存在于種群內(nèi)，標(biāo)記檢測(cè)出不結(jié)球白菜種群間的基因流平均水平較高，說(shuō)明群體間基因交流較多，種群間遺傳分化程度相對(duì)較低；另外分析還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用多種標(biāo)記可有效提高對(duì)資源多樣性研究的準(zhǔn)確性。三種標(biāo)記的研究結(jié)論在起到相互驗(yàn)證的同時(shí)，還存在互補(bǔ)的作用。Mantel-test檢測(cè)結(jié)果也顯示，三種標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果間的相關(guān)性較低，說(shuō)明它們分別從不同的角度反映了不結(jié)球白菜的遺傳背景，綜合三種標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果

8、對(duì)不結(jié)球白菜的遺傳多樣性進(jìn)行分析，可以更真實(shí)地反映資源間的親緣關(guān)系，更準(zhǔn)確全面地分析資源的遺傳多樣性。本研究中聯(lián)合標(biāo)記的使用已顯示出優(yōu)越性，在資源聚類分析中效果更為明顯，聯(lián)合標(biāo)記的聚類結(jié)果比單個(gè)標(biāo)記的聚類結(jié)果更有規(guī)律。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)資源的9個(gè)特異標(biāo)記，通過(guò)對(duì)特異片段的克隆測(cè)序，成功轉(zhuǎn)化一個(gè)特異標(biāo)記(UBC834-206)為SCAR標(biāo)記(SU834)，可以快速、特異鑒別該資源。 3.利用RAPD、ISSR和SRAP三種標(biāo)記技術(shù)，

9、對(duì)由雙親及其F1組成的兩個(gè)組合進(jìn)行分析。結(jié)果表明有3個(gè)RAPD引物、3個(gè)ISSR引物和3對(duì)SRAP引物可擴(kuò)增出“新夏青2號(hào)”雙親的互補(bǔ)特征帶，將其雙親和F1區(qū)分出來(lái)；對(duì)“新綠”的引物篩選結(jié)果表明，有3個(gè)ISSR引物和2對(duì)SRAP引物可擴(kuò)增出雙親的互補(bǔ)特征帶，將雙親和Fl區(qū)分出來(lái)。從而建立了由RAPD、ISSR和SRAP三種標(biāo)記技術(shù)組成的鑒定親本及其雜種的分子指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜，為種子純度的鑒定開(kāi)辟了新的技術(shù)途徑，為新品種知識(shí)