促CD4+CD25-naiveT細胞Treg化重組蛋白的表達、純化、復性及功能鑒定.pdf

1、目的:構建體外促CD4+CD25-na(i)ve T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+regular T細胞(Treg)的重組蛋白原核表達質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1,誘導表達、純化及體外復性蛋白Pc2-C4-L-hmTGF-β1(簡稱pCLT),并鑒定復性后蛋白功能。
　　 方法:
　　 1.表達載體的構建及表達條件的優(yōu)化:分別雙酶切已鑒定正確質(zhì)粒Pcr2.1-C2-C4-linker和Pc

2、r2.1-hmTGF-β1,回收目的片段C2-C4-linker和hmTGF-β1,通過T4連接酶定向連接hmTGF-β1和線性化原核表達載體pET28a,連接三片段C2-C4-linker、hmTGF-β1和pET28a,獲得重組蛋白Pclt原核表達質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1。構建正確質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3),誘導劑IPTG誘導蛋白Pclt表達,

3、Bandsean軟件分析蛋白表達量,western blot鑒定所表達蛋白及表達形式,通過探索誘導劑IPTG濃度和誘導時間對誘導條件進行優(yōu)化。
　　 2.蛋白的純化及復性:包涵體洗滌及鎳親和層析法純化目的蛋白,通過梯度濃度咪唑洗脫建立蛋白純化條件,Bandscan軟件分析純化效果。透析復性方式復性純化后蛋白pCLT,建立尿素梯度透析復性蛋白,通過改變復性液組分和復性前蛋白濃度,摸索蛋白復性最佳條件。
　　 3.體外蛋白質(zhì)

4、和功能鑒定:通過檢測蛋白對體外培養(yǎng)細胞增殖的影響和免疫共沉淀法鑒定復性后蛋白的活性。復性后蛋白與人舌鱗癌細胞Tca8113和人T淋巴細胞白血病細胞Hut78及Jurkat E6-1共培養(yǎng),通過MTT法測共培養(yǎng)后細胞增增殖的情況,分析不同蛋白濃度和不同時間,蛋白對細胞增殖的影響,分析復性后重組蛋白pCLT與hmTGF-β1抑制細胞增殖的差異。
　　 結果:
　　 ①酶切鑒定結果與測序結果與理論值相符,成功構建原核表達質(zhì)粒p

5、ET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1。IPTG誘導蛋白表達,SDS-PAGE電泳分析,分別在約33kD處出現(xiàn)了一條新的蛋白條帶,主要以包涵體形式獲得表達,western blot結果顯示該條帶能夠與His抗體特異性結合;在誘導劑IPTG濃度為O.1mmol/L,誘導表達6h后,蛋白pCLT達到最大表達量,所表達蛋白占菌體總蛋白量40％左右。
　　 ②鎳親和層析純化目的蛋白,純度達90％以上。透析復性法探索得到蛋白復性最佳

6、條件。
　　 ③免疫共沉淀檢測復性后重組蛋白pCLT可與Hut78及Jurkat E6-1細胞表面CD4分子結合,復性后蛋白pCLT對照分子hmTGF-β1均可抑制細胞Tca8113的增殖,并存在一定的量-效和時-效關系;重組蛋白pCLT較對照分子hmTGF-β1對CD4+Jurkat E6-1細胞表現(xiàn)出較高的抑制率。
　　 結論:
　　 ①成功構建促Treg化重組分子原核表達質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-h