BMP-2-膠原-摻鍶羥基磷灰石成骨活性材料的研究.pdf

1、第一部分骨形態(tài)蛋白-2 對人臍帶間充質細胞增殖和分化的影響
　　 目的:探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）對人臍帶間充質干細胞（hUCMSC）的增殖和分化的影響。
　　 方法:體外培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，用流式細胞儀鑒定細胞表面CD34、CD45、CD105、CD45、CD73和HLA-DR分子的表達。實驗分為6組，分別是10％血清DMEM、10％血清DMEM+成骨誘導培養(yǎng)基、10％血清DMEM+BMP-2(20ug/

2、ml)、2％血清DMEM、2％血清DMEM+成骨誘導培養(yǎng)基、2％血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)，噻唑藍(MTT)比色法觀察不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對人臍帶間充質干細胞的增殖影響，流式細胞術檢測BMP-2 作用后細胞表面STRO-1表達的變化，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測量BMP-2 作用后人臍帶間充質干細胞的骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）、I 型膠原蛋白(COL1)的mRNA表達變化，堿性磷酸酶染色觀察人臍帶間充質

3、干細胞在BMP-2 培養(yǎng)基作用下細胞堿性磷酸酶表達陽性細胞的比例變化，Von kossa 染色試驗觀察BMP-2 對人臍帶間充質干細胞鈣結節(jié)形成的情況。
　　 結果:人臍帶間充質干細胞經流式細胞術鑒定為CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)細胞。對比無BMP-2和加BMP-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞1，3，5，7天，雖然細胞的增殖率在上升，但是在組間比較，無明顯意義，同時在

4、2％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，hUCMSC的增殖促進才10％左右。BMP-2 培養(yǎng)7天后細胞表面STRO-1 陽性細胞比例上升明顯，由25.1±4.0 上升至51.1±6.4。BMP-2 培養(yǎng)條件下，COL1mRNA的表達可以見到增強，OPNmRNA出現表達，ALPmRNA 比無BMP-2 培養(yǎng)出現明顯增強。在BMP-2 培養(yǎng)條件下，堿性磷酸酶染色出現大片陽性染色。在培養(yǎng)28天，Von kossa 染色出現明顯的鈣結節(jié)。
　　

5、結論：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 對人臍帶間充質干細胞成骨誘導分化作用明顯，而增殖作用很弱。
　　 第二部分鍶對人臍帶間充質細胞成骨分化影響的研究
　　 目的：探討氯化鍶誘導人臍帶間充質干細胞（hUCMSC）成骨分化過程中β-連接蛋白（β-Catenin）的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，實驗分為3組，空白組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基，對照組：10％胎牛血清+DMEM 培養(yǎng)基+成骨培養(yǎng)基，實驗組：1

6、0％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基+氯化鍶，檢測3組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后人臍帶間充質細胞的堿性磷酸酶活性變化。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測量人臍帶間充質干細胞的骨橋蛋白（OPN）、β-Catenin、I 型膠原蛋白(COL1)的mRNA表達變化，蛋白印跡法檢測β-Catenin 蛋白表達的變化。熒光染色觀察在加入氯化鍶的培養(yǎng)基中β-Catenin的表達。Von kossa 染色試驗觀察人臍帶間充質干細胞鈣結節(jié)形成的情況。
　　

7、結果：實驗組細胞在第5天，堿性磷酸酶活性由39.871±8.166 U/g.prot 增加到70.317±14.231U/g.prot，在第14天，實驗組的堿性磷酸酶的活性可以高達138.617±40.207 U/g.prot，與空白組和對照組相比都有明顯增加。在實驗組人臍帶間充質干細胞的堿性磷酸酶（ALP）mRNA 出現高表達?？瞻捉M的骨橋蛋白（OPN）表達很弱，而對照組和實驗組的OPN 出現明顯的表達。對比空白組和對照組，實驗組I

8、型膠原蛋白（COL1）的表達可以見到明顯增強?？瞻捉M的β-Catenin 蛋白表達很弱，而對照組和實驗組的β-Catenin 蛋白出現明顯的表達。細胞熒光觀察到在還有氯化鍶培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中出現細胞漿內紅色熒光，部分細胞核也有紅色熒光。含有氯化鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的鈣結節(jié)。
　　 結論：β-Catenin是氯化鍶誘導人臍帶間充質干細胞細胞成骨誘導分化中重要通路蛋白。
　　 第三部分骨

9、形態(tài)蛋白-2 聯合氯化鍶對人臍帶間充質細胞成骨分化實驗
　　 目的：探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）聯合氯化鍶對人臍帶間充質干細胞（hUCMSC）
　　 的增值和分化的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，實驗分為3組，空白組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基，對照組：10％胎牛血清+DMEM 培養(yǎng)基+成骨培養(yǎng)基，實驗組：10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基+BMP-2+氯化鍶，噻唑藍(MTT)比色法觀察人

10、臍帶間充質干細胞的增值效果，并檢測3組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后人臍帶間充質細胞的堿性磷酸酶活性變化，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測量不同組人臍帶間充質干細胞的骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）、I 型膠原蛋白(type 1collagen,COL1)的mRNA表達，蛋白印跡法檢測smad和p38 蛋表達的變化。von kossa染色試驗觀察人臍帶間充質干細胞鈣結節(jié)形成的情況。
　　 結果：實驗組的人臍帶間充質干細胞增殖率在

11、第5天和第7天是明顯高于空白組和對照組。實驗組細胞在第5天，堿性磷酸酶活性就由33.443±9.061U/g.prot 增加到80.209±17.011 U/g.prot，在第14天，實驗組的堿性磷酸酶的活性可以高達145.705±45.871 U/g.prot，對比空白組和對照組都有明顯增加。在實驗組人臍帶間充質干細胞的堿性磷酸酶（ALP）mRNA 出現高表達?？瞻捉M的骨橋蛋白（OPN）表達很弱，而對照組和實驗組的OPN 出現明顯的表

12、達。對比空白組和對照組，實驗組I 型膠原蛋白（COL1）的表達可以見到明顯增強。實驗組中人臍帶間充質干細胞的Smad1/5/8 蛋白出現高表達?？瞻捉M的P38 蛋白表達很弱，而對照組和實驗組的P38 蛋白出現明顯的表達，含有BMP-2和氯化鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的鈣結節(jié)。
　　 結論：聯合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和氯化鍶對人臍帶間充質干細胞細胞增殖和成骨誘導分化都有促進作用。
　　 第四部分

13、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料制備和顱骨缺損修復實驗
　　 目的：制備BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料并探討其修復大鼠顱骨缺損的可行性和有效性。
　　 方法：用1 型膠原制備單純膠原、膠原/羥基磷灰石、膠原/摻鍶羥基磷灰石、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石4組骨修復材料，并進行掃描電鏡觀察4 種材料表面的結構。實驗動物分為4組，每組12只大鼠，在大鼠頭顱制備顱骨極限骨缺損模型，并將上述骨修復材料分別植入骨缺損處

14、。術后12周取大鼠顱骨，CT 掃描觀察骨缺損修復影像學。HE和Masson 染色觀察骨缺損組織學，并在骨缺損及其周圍新生骨部位行骨橋蛋白（OPN）和β-catenin 免疫組織化學染色。
　　 結果：在掃描電鏡下檢測，可以發(fā)現單純的膠原材料為交織樣物質結構，膠原/羥基磷灰石材料為交織晶體板狀結構。膠原/摻鍶羥基磷灰石和BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料晶體結構為單晶體交織狀。12周后，骨缺損顱骨CT 掃描發(fā)現單純膠原組的顱骨缺

15、損可見輕微的云霧狀高密度影，三維重建可見明顯的骨質缺損，骨缺損部位平均CT 值為98.5±10.2 hu。而膠原/羥基磷灰石材料、膠原/摻鍶羥基磷灰石、BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料在12周顱骨缺損部位都有片狀高密度影，但是骨缺損部位的CT 值有明顯的差異，BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石材料缺損部位CT 值最高。HE和Masson 染色見BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石組，骨質愈合完全，原骨缺損處多為紅色成熟骨。膠原/摻鍶羥基磷

16、灰石組植入區(qū)內藍色的新生骨較多，材料邊緣與骨組織結合緊密牢固，骨痂橋接完全，內含成熟骨。膠原/羥基磷灰石材料組植入區(qū)，在植入材料邊緣新生骨形成，界限仍然清晰。單純膠原組骨質未愈合，骨缺損處為大量膠原組織，淡藍色條索狀結構，中間未見軟骨及成熟骨形成。BMP-2/膠原/摻鍶羥基磷灰石組存在大量棕色的骨橋蛋白和β-catenin 染色陽性新生骨組織，而膠原/摻鍶羥基磷灰石組和膠原/羥基磷灰石組的骨橋蛋白和β-catenin 陽性新生骨組織依次