HA-CollagenI復(fù)合材料誘導(dǎo)成骨機(jī)理及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 基于仿生觀念構(gòu)建的羥基磷灰石／I型膠原復(fù)合材料，和骨的結(jié)構(gòu)相似，具有組織相容性和骨傳導(dǎo)性，有學(xué)者報(bào)道有骨誘導(dǎo)作用，成為目前研究的熱點(diǎn)，但是目前對(duì)其骨誘導(dǎo)機(jī)理無系統(tǒng)的研究。HA／CollagenI仿生材料已成功地在長骨節(jié)段缺損中生成骨組織，但在脊柱的生物學(xué)和生物力學(xué)愈合環(huán)境中應(yīng)用，目前很少研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測HA／CollagenI復(fù)合材料的組織相容性和肌內(nèi)植入后異位成骨的能力，對(duì)其誘導(dǎo)成骨的機(jī)理進(jìn)行探索。并觀察HA／Col

2、lagenI復(fù)合材料植入體內(nèi)后促進(jìn)脊柱融合情況，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。 材料與方法 在低溫條件下(溫度為200℃)采用水熱法形成的羥基磷灰石(HA)，為40-60um的小顆粒，孔徑約300um，和I型膠原復(fù)合，組成HA／CollagenI復(fù)合材料，其中I型膠原占70％，羥基磷灰石占30％。制作成0.4×0.8×3cm的塊狀。采用體內(nèi)試驗(yàn)的肌內(nèi)植入模型，在一般形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，利用酶組織化學(xué)法，觀察其組織相容

3、性，觀察指標(biāo)有：(1)大體觀察(2)組織形態(tài)學(xué)觀察：石蠟切片，HE染色，光鏡觀察細(xì)胞和肌肉組織的形態(tài)學(xué)變化。(3)酶組織化學(xué)觀察：冰凍切片，用于酶組織化學(xué)染色。選琥珀酸脫氫酶(SDH)、輔酶I脫氫酶(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)。將材料植入兔背部肌肉內(nèi)，觀察其異位成骨的能力，并檢測成骨過程中相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞因子、和局部離子環(huán)境，探索其骨誘導(dǎo)機(jī)理，觀察指標(biāo)有：(1)大體觀察(2)組織形態(tài)學(xué)觀察：石蠟切片，行HE和Masson染色，光鏡

4、觀察材料及周圍組織的變化和成骨的情況。(3)誘導(dǎo)成骨因素的檢測方法：a、間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測：石蠟切片，SH2單抗免疫組化染色，檢測MSC的特異性抗原。b、破骨細(xì)胞的檢測：石蠟切片，23C6單抗免疫組化染色，檢測破骨細(xì)胞的特異性抗原。c、BMP-2的檢測：石蠟切片，BMP-2單抗免疫組化染色，檢測相關(guān)細(xì)胞BMP-2的表達(dá)。d、HA／Collagen材料降解代謝過程：材料與茜素紅和鈣黃綠素共染2h后植入，不同時(shí)間點(diǎn)取材、石蠟切片，在激光共聚

5、焦顯微鏡下觀察染料的分布情況。采用新西蘭兔脊柱后外側(cè)融合模型，將HA／Collagenl材料復(fù)合自體骨髓植入兔L5、L6橫突間，進(jìn)行脊柱后外側(cè)融合，通過組織學(xué)、生物力學(xué)、影像學(xué)的檢測，觀察其促進(jìn)脊柱融合的能力。采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，45只成年新西蘭兔， 雌雄不限分為5組，每組9只。A組(9只)：單純HA／Col lagenI材料。B組(9只)：自體骨髓復(fù)合HA／CollagenI材料。c組(9只)：自體髂骨移植。D組(9只)：深

6、低溫冷凍同種異體骨。E組(9只)：空白對(duì)照組(單純L5、L6橫突去皮質(zhì)化，不植入材料)。術(shù)后4周、8周、12周分別取材作檢測。觀察指標(biāo)為：(1)大體觀察(2)組織形態(tài)學(xué)觀察：石蠟切片，行HE染色和masson染色，光鏡觀察材料及周圍組織的變化和成骨的情況。(3)X片、CT檢測判斷脊柱的融合率。(4)手觸動(dòng)法判斷脊柱的融合率。(5)融合脊柱節(jié)段的生物力學(xué)檢測 結(jié)果HA／CollagenI復(fù)合材料植入兔肌肉后，在手術(shù)創(chuàng)傷造成的組織損

7、害消除后，材料周圍的炎癥細(xì)胞迅速消退，酶組織化學(xué)染色顯示酶活性—過性下降，3到4周后酶活性恢復(fù)正常，材料具有良好的組織相容性。在HA／CollagenI復(fù)合材料肌肉內(nèi)植入的異位成骨實(shí)驗(yàn)中，手術(shù)后12周，HA／CollagenI復(fù)合材料的孔隙中有新生骨組織形成，材料逐漸降解。通過一般組織學(xué)方法、免疫組織學(xué)方法、和一些特殊染色方法結(jié)合，發(fā)現(xiàn)新骨形成前，長入材料內(nèi)部的問充質(zhì)組織中有一些細(xì)胞，SH2免疫組織化學(xué)染色陽性，證明是間充質(zhì)干細(xì)胞，并且

8、隨著時(shí)間延長，向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表達(dá)BMP-2。，材料內(nèi)出現(xiàn)多核、體積大的細(xì)胞，23C6免疫組織化學(xué)染色鑒定為破骨細(xì)胞，提示破骨細(xì)胞參與了材料的降解。材料復(fù)合自體骨髓作為骨移植替代材料，植入兔腰椎后外側(cè)橫突間進(jìn)行脊柱融合。手術(shù)后12周時(shí)，肉眼觀察可見骨髓復(fù)合HA／CollagenI材料組和單純復(fù)合材料組的人工骨材料已基本降解。骨髓復(fù)合HA／CollagenI復(fù)合材料組和自體骨組的動(dòng)物橫突間均存在連接物，與橫突間交界處明顯融合為整體。組織學(xué)

9、觀察示材料中央大量類骨樣物質(zhì)形成，被纖維血管組織包繞，破骨細(xì)胞長入類骨樣物質(zhì)內(nèi)部，促使其降解，成骨細(xì)胞及新生血管長入，逐漸形成新生骨組織。X線片、CT和手觸動(dòng)法表明骨髓復(fù)合HA／CollagenI復(fù)合材料組與自體骨移植組促進(jìn)脊柱融合的作用相似。生物力學(xué)檢測結(jié)果示自體骨髓復(fù)合HA／CollagenI材料組和自體骨移植組融合強(qiáng)度相當(dāng)，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05) 結(jié)論HA／CollagenI復(fù)合材料對(duì)活體組織沒有毒性，具有良好