白藜蘆醇影響血管平滑肌細(xì)胞成骨樣轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的:研究白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對血管鈣化的抑制作用，觀察不同濃度的Res對高鈣、高磷誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞(hVSMC)成骨樣轉(zhuǎn)化的影響。為終末期腎病(ESRD)患者血管鈣化的預(yù)防提供一定的依據(jù)。
　　方法:1.無菌條件下取胎兒（男嬰，足月）臍帶，剝離臍動(dòng)脈，無菌PBS清洗，剝除外膜，胰酶消化法提取臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，體外培養(yǎng)人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)和α-SMA標(biāo)記進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。根據(jù)培養(yǎng)液中含鈣

2、磷濃度分為陰性對照組(NC)及實(shí)驗(yàn)組(PC)，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)白藜蘆醇的濃度分為實(shí)驗(yàn)組1(T1，5μ mol/L Res)、實(shí)驗(yàn)組2（T2，10μ mol/LRes）、實(shí)驗(yàn)組3(T3，20μ mol/L Res)。各組培養(yǎng)12天，2-3天換液1次。
　　2.用含高鈣、高磷（Ca2+:2.5mmol/L，P:3.0mmol/L）的培養(yǎng)基誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的成骨樣轉(zhuǎn)化，通過茜紅素染色法于形態(tài)學(xué)上鑒定平滑肌細(xì)胞的成骨樣轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)12天后，采用偶氮

3、胂Ⅲ檢測各組細(xì)胞鈣含量，對平滑肌細(xì)胞的鈣化進(jìn)行定量檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組hVSMC成骨樣轉(zhuǎn)化相關(guān)基因BAP、BMP2、OPN的表達(dá)水平，Western blot和免疫熒光標(biāo)記方法檢測各組BMP2、OPN的表達(dá)水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS18.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用(x)±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，組間資料比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， P

4、＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.原代細(xì)胞鑒定:倒置顯微鏡下平滑肌細(xì)胞呈長梭形或多邊形，細(xì)胞生長呈“峰-谷樣”。免疫組化α-SMA染色見細(xì)胞胞漿內(nèi)α-SMA表達(dá)豐富，高倍鏡下呈細(xì)絲狀。
　　2.與陰性對照組比較，高鈣、高磷組的細(xì)胞層見顆粒樣沉積，茜紅素染色見橘紅色團(tuán)塊狀沉積，鈣含量檢測顯示實(shí)驗(yàn)組鈣含量明顯增加，達(dá)5倍(P＜0.05)，其α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)下降，而成骨樣細(xì)胞特異性標(biāo)記BAP、BMP2、OPN mRNA和

5、蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)。平滑肌細(xì)胞鈣化模型成功建立。
　　3.不同濃度Res干預(yù)后，與高鈣、高磷組比較，T1、T2、T3組細(xì)胞內(nèi)鈣含量下降， BAP、 BMP2、 OPN mRNA水平降低;BMP2及OPN的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，并與Res濃度呈負(fù)相關(guān)。
　　4.免疫熒光檢測結(jié)果同樣證實(shí):與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組OPN、BMP2的表達(dá)升高，與Res干預(yù)后，隨Res濃度升高，OPN、BMP2的表達(dá)逐漸下降。