灌注性三維動(dòng)態(tài)細(xì)胞接種和培養(yǎng)方法構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨缺損的修復(fù)和重建是骨科臨床面臨的問題之一。自體骨是骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)，但其來(lái)源有限且易引發(fā)供區(qū)并發(fā)癥；同種異體骨和異種骨也可用于治療骨缺損，但存在免疫排斥反應(yīng)和病毒傳播等潛在危險(xiǎn)。利用組織工程技術(shù)將成骨性種子細(xì)胞與多孔支架材料復(fù)合后體外構(gòu)建組織工程骨為骨缺損的臨床治療提供了新途徑。但是，傳統(tǒng)的靜態(tài)細(xì)胞接種和培養(yǎng)方法存在細(xì)胞接種率低和分布均勻性差、支架內(nèi)氣體交換及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足等缺陷，降低了組織工程骨的成骨活性。本研究利用自行設(shè)計(jì)的灌注式生物

2、反應(yīng)器進(jìn)行成骨細(xì)胞的灌注性三維動(dòng)態(tài)接種和培養(yǎng)，以提高細(xì)胞的接種率和分布均勻性，促進(jìn)支架內(nèi)細(xì)胞的均勻增殖，增強(qiáng)組織工程骨的成骨活性和對(duì)節(jié)段性骨缺損的修復(fù)效果。
　　1.成骨細(xì)胞在四種多孔支架材料內(nèi)的灌注性三維動(dòng)態(tài)接種研究
　　目的：檢驗(yàn)自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器用于成骨細(xì)胞灌注接種的可行性，對(duì)比四種支架材料的細(xì)胞接種效果，篩選較優(yōu)的支架材料。方法：選取異體松質(zhì)骨粒、多孔磷酸三鈣（β-TCP）、明膠海綿、膠原蛋白海綿四種支架材料

3、作為載體，使用自行設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器進(jìn)行人胚胎成骨細(xì)胞的灌注接種，以靜態(tài)接種方法為對(duì)照，通過細(xì)胞活力、活細(xì)胞接種率檢測(cè)及組織學(xué)觀察和計(jì)量，比較兩種接種方法和四種支架材料對(duì)細(xì)胞接種效果的影響。結(jié)果：β-TCP和明膠海綿：灌注接種優(yōu)于靜態(tài)接種（P<0.05）；松質(zhì)骨粒：兩接種組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；膠原蛋白海綿：灌注接種組的細(xì)胞活力、活細(xì)胞接種率和細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于靜態(tài)接種組（P<0.05），細(xì)胞分布均勻性則無(wú)顯著差異。灌注接種時(shí)，β-TCP、明膠海綿

4、的接種效果優(yōu)于松質(zhì)骨粒和膠原蛋白海綿，靜態(tài)接種時(shí)，膠原蛋白海綿的細(xì)胞接種率和細(xì)胞計(jì)數(shù)最高。結(jié)論本研究自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器提高了β-TCP和明膠海綿支架內(nèi)成骨細(xì)胞的接種效率和分布均勻性。松質(zhì)骨粒和膠原蛋白海綿不適于灌注接種方法，但膠原蛋白海綿適于靜態(tài)接種方法。
　　2.成骨細(xì)胞在多孔β-TCP支架內(nèi)灌注性接種和培養(yǎng)的優(yōu)化研究
　　目的：探討自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器用于成骨細(xì)胞灌注性接種和培養(yǎng)的可行性，對(duì)比不同條件對(duì)細(xì)胞

5、接種和培養(yǎng)效果的影響，篩選較優(yōu)的細(xì)胞接種和培養(yǎng)條件。方法：以多孔β-TCP支架為載體，采用自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器進(jìn)行人胚胎成骨細(xì)胞的灌注接種和短期灌注培養(yǎng)，以靜態(tài)接種方法為對(duì)照，比較細(xì)胞接種時(shí)間、細(xì)胞懸液密度、灌注接種及灌注培養(yǎng)速率的變化對(duì)活細(xì)胞接種率和細(xì)胞活力的影響。結(jié)果：灌注接種12h接種率顯著高于8h和4h（P<0.05），但與24h間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；灌注接種細(xì)胞懸液密度為2×105/mL時(shí)接種率顯著高于1×105/mL（P<0

6、.05），但與5×105/mL相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；灌注速率為1mL/min時(shí)灌注接種率最高。灌注培養(yǎng)24h內(nèi)、灌注速率0.5mL/min～2mL/min間細(xì)胞活力無(wú)顯著變化，但至4mL/min時(shí)細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05）；24h至4d內(nèi)灌注速率2mL/min時(shí)細(xì)胞活力最高。結(jié)論：細(xì)胞接種時(shí)間、細(xì)胞懸液密度、灌注接種和灌注培養(yǎng)速率等因素均影響細(xì)胞接種和培養(yǎng)效果；在本研究實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞灌注性接種和培養(yǎng)的最優(yōu)條件為：接種時(shí)間12h～24

7、h，細(xì)胞懸液密度2×105/mL～5×105/mL，灌注接種速率1mL/min，灌注培養(yǎng)速率0.5mL/min～2mL/min（24h內(nèi)）和2mL/min（24h～4d）。
　　3.利用灌注性細(xì)胞接種/培養(yǎng)系統(tǒng)體外構(gòu)建組織工程骨
　　目的：利用灌注性細(xì)胞接種和培養(yǎng)系統(tǒng)體外構(gòu)建組織工程骨，以靜態(tài)接種和靜態(tài)培養(yǎng)（SSSC）以及靜態(tài)接種和灌注培養(yǎng)（SSPC）為對(duì)照，對(duì)比三種方法的構(gòu)建效果。方法：以多孔β-TCP支架為載體，采用自行

8、設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器進(jìn)行人胚胎成骨細(xì)胞的灌注接種和灌注培養(yǎng)（PSPC），以SSSC法和SSPC法為對(duì)照，通過葡萄糖日耗量、細(xì)胞活力檢測(cè)、掃描電鏡（SEM）以及硬組織切片觀察和組織形態(tài)學(xué)計(jì)量，比較三種方法的細(xì)胞增殖和分布情況。結(jié)果：三組的葡萄糖日耗量均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，SSPC組和PSPC組的葡萄糖日耗量高于SSSC組（P<0.05），培養(yǎng)6d內(nèi)PSPC組的葡萄糖日耗量高于SSPC組（P<0.05），培養(yǎng)8d時(shí)兩組的葡萄糖日耗量接近一致

9、。SSPC組和PSPC組細(xì)胞活力無(wú)顯著差異，但均高于SSSC組細(xì)胞活力（P<0.05）。SEM及組織學(xué)觀察顯示SSSC組細(xì)胞僅分布在支架周緣而SSPC組和PSPC組細(xì)胞在支架內(nèi)部及周邊均有分布且兩組的細(xì)胞占孔率均高于SSSC組（P<0.05）。結(jié)論：PSPC法體外構(gòu)建組織工程骨的效果優(yōu)于SSSC法；培養(yǎng)8d后SSPC法和PSPC法的構(gòu)建效果相似，但PSPC法可顯著促進(jìn)培養(yǎng)初期細(xì)胞增殖從而加快組織構(gòu)建速度，隨著支架載體體積和孔隙空間的增加

10、這一優(yōu)勢(shì)可能更加明顯。
　　4.灌注法結(jié)合可控微結(jié)構(gòu)β-TCP支架體外構(gòu)建大體積組織工程骨
　　目的：探討采用灌注培養(yǎng)方法和可控微結(jié)構(gòu)β-TCP支架體外構(gòu)建大體積組織工程骨的構(gòu)建效果以及支架微結(jié)構(gòu)在其中的作用。方法：以快速成形（RP）技術(shù)制備的大體積可控微結(jié)構(gòu)β-TCP支架為載體，采用自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器進(jìn)行人胚胎成骨細(xì)胞的灌注性三維培養(yǎng)，以靜態(tài)培養(yǎng)方法為對(duì)照，通過葡萄糖日消耗量、細(xì)胞活力檢測(cè)、組織學(xué)觀察和計(jì)量、SEM

11、觀察及X射線能譜（EDX）分析，比較兩種培養(yǎng)方法對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞增殖和分布的影響。結(jié)果：葡萄糖日耗量和細(xì)胞活力均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而升高（P<0.05），灌注培養(yǎng)組的葡萄糖日耗量和細(xì)胞活力顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組（P<0.05）。組織學(xué)及SEM觀察顯示靜態(tài)培養(yǎng)條件下細(xì)胞僅在支架邊緣存活而灌注培養(yǎng)條件下細(xì)胞在支架內(nèi)部和邊緣均能正常生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯多于靜態(tài)培養(yǎng)組；灌注培養(yǎng)支架內(nèi)形成了以正交管道結(jié)構(gòu)為模板的新生三維組織。EDX分析證實(shí)胞外類球體基質(zhì)為磷酸

12、鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論：灌注培養(yǎng)方法結(jié)合可控微結(jié)構(gòu)β-TCP支架促進(jìn)大體積支架內(nèi)細(xì)胞均勻擴(kuò)增和成骨分化；可控正交管道結(jié)構(gòu)利于支架內(nèi)形成均勻一致的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和流體應(yīng)力刺激環(huán)境；可控微結(jié)構(gòu)可能影響新生組織的形態(tài)和分布。
　　5.灌注法構(gòu)建組織工程骨修復(fù)兔橈骨節(jié)段性缺損研究
　　目的：探討灌注性細(xì)胞接種和培養(yǎng)方法體外構(gòu)建組織工程骨以及修復(fù)兔橈骨節(jié)段性缺損的可行性和效果。方法：以RP技術(shù)制備的可控微結(jié)構(gòu)β-TCP支架為載體，采用自行設(shè)計(jì)的生物反

13、應(yīng)器進(jìn)行兔成骨細(xì)胞的灌注接種和灌注培養(yǎng)（PSPC），以靜態(tài)接種和靜態(tài)培養(yǎng)（SSSC）以及靜態(tài)接種和灌注培養(yǎng)（SSPC）方法為對(duì)照，通過葡萄糖日耗量、細(xì)胞活力檢測(cè)和組織學(xué)觀察，對(duì)比三種方法的細(xì)胞增殖和分布情況；將組織工程骨植入兔橈骨節(jié)段性骨缺損，以缺損曠置、自體骨和單純?chǔ)?TCP支架為對(duì)照，通過影像學(xué)和組織學(xué)檢查比較骨缺損的修復(fù)效果。結(jié)果：PSPC組的葡萄糖日耗量和細(xì)胞活力高于SSPC和SSSC組（P<0.05），SSSC組細(xì)胞僅在支架邊

14、緣分布而PSPC組和SSPC組細(xì)胞在支架內(nèi)部和邊緣均有分布，PSPC組的細(xì)胞占孔率高于SSPC和SSSC組（P<0.05）。植入兔橈骨缺損12周后自體骨組6例全部愈合（6/6），SSPC組有2例愈合（2/6），PSPC組有4例愈合（4/6），其余各組缺損均未愈合。PSPC組的新骨生成量高于SSPC組、SSPC組和單純?chǔ)?TCP組（P<0.05）。β-TCP殘余量與SSPC組相比無(wú)顯著性差異但低于單純?chǔ)?TCP和SSSC組（P<0.05）

15、。結(jié)論：PSPC法可促進(jìn)支架內(nèi)細(xì)胞增殖和均勻分布，構(gòu)建的組織工程骨可修復(fù)兔橈骨節(jié)段性缺損，修復(fù)效果優(yōu)于SSSC法和SSPC法但仍低于自體骨。RP支架的降解性有待改進(jìn)。體內(nèi)血管化和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙可能導(dǎo)致支架內(nèi)部分細(xì)胞死亡從而減弱了組織工程骨的修復(fù)效果。
　　綜上所述，以上研究結(jié)果說(shuō)明，本研究自行設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器可用于多孔支架材料上的成骨細(xì)胞灌注性接種和培養(yǎng)；與傳統(tǒng)的靜態(tài)細(xì)胞接種和培養(yǎng)方法以及采用靜態(tài)接種的灌注培養(yǎng)方法相比，灌注性