牙菌斑尿素代謝與尿素酶基因表達(dá)的研究.pdf

1、從唾液和齦溝液中持續(xù)分泌的尿素被口腔細(xì)菌尿素酶快速分解產(chǎn)生氨和二氧化碳。尿素水解的堿性產(chǎn)物通過中和細(xì)菌產(chǎn)酸以維持牙菌斑的中性pH值環(huán)境，有助于穩(wěn)定牙菌斑菌群平衡，防止牙釉質(zhì)脫礦和促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化。因此，尿素水解被認(rèn)為對防止齲病發(fā)生起到了重要作用。迄今為止，關(guān)于牙菌斑中哪些細(xì)菌具有尿素酶活性以及哪些細(xì)菌決定牙菌斑尿素酶活性的問題尚不清楚，對口腔細(xì)菌尿素酶基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制缺乏認(rèn)識。本研究首先對牙菌斑中常駐細(xì)菌進(jìn)行尿素酶活性檢測，比較細(xì)菌間

2、尿素酶的酶促動力學(xué)特征，尋找決定牙菌斑尿素酶活性的關(guān)鍵細(xì)菌。在此基礎(chǔ)上，以內(nèi)氏放線菌作為研究對象，了解細(xì)菌尿素代謝的生物學(xué)特征，模擬內(nèi)氏放線菌在牙菌斑中的生物膜狀態(tài)，探索環(huán)境因素和生存狀態(tài)對細(xì)菌尿素酶活性和尿素酶基因表達(dá)的影響。 方法采用連續(xù)培養(yǎng)的恒化器模型培養(yǎng)內(nèi)氏放線菌單菌種生物膜，使用酶底物反應(yīng)法和Real-time PCR技術(shù)分別在生化水平和基因水平檢測氮源物質(zhì)、糖源物質(zhì)、pH值和清除率對尿素酶活性和尿素酶UreC基因表達(dá)

3、的影響，同時比較細(xì)菌在膜狀態(tài)下和浮游狀態(tài)下尿素酶活性和尿素酶UreC基因表達(dá)的差異。 結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，牙菌斑生物膜中細(xì)菌有活躍的尿素代謝活動，唾液鏈球菌，內(nèi)氏放線菌能穩(wěn)定表達(dá)尿素酶活性，血液鏈球菌和粘性放線菌尿素酶活性不穩(wěn)定。牙菌斑生物膜結(jié)構(gòu)有利于尿素酶活性的發(fā)揮。與其他氮源物質(zhì)相比，尿素更有利于細(xì)菌生長，在臨床牙菌斑能夠檢測到的pH4.0～7.0范圍內(nèi)，內(nèi)氏放線菌尿素水解可以提高細(xì)菌的耐酸性，對牙菌斑酸堿平衡有一定的調(diào)節(jié)作用。研

4、究生物膜狀態(tài)的內(nèi)氏放線菌發(fā)現(xiàn)，在如下培養(yǎng)條件下細(xì)菌尿素酶活性均有不同程度提高：培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)缺乏；培養(yǎng)基中糖源物質(zhì)豐富；培養(yǎng)基保持在中性pH值；培養(yǎng)基保持高清除率。但是僅氮源物質(zhì)缺乏和高清除率對尿素酶UreC基因轉(zhuǎn)錄具有誘導(dǎo)作用。在相同的培養(yǎng)條件下，內(nèi)氏放線菌在膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)相比，尿素酶活性高出10～16倍；尿素酶UreC基因轉(zhuǎn)錄水平高出1.7～2.4倍。 結(jié)論 內(nèi)氏放線菌是牙菌斑尿素酶活性的重要細(xì)菌；內(nèi)氏放線菌在生物膜狀