云南紅豆杉枝葉中抗癌活性成分的提取工藝與黃酮類化合物的研究.pdf

1、腫瘤是危害人類生命的疾病，死亡率僅次于心血管疾病，居各類疾病死亡率的第二位。長期以來，尋找抗癌生物資源與天然藥物成為各國醫(yī)學、藥學、化學及生物學家的一個共同愿望。近年來，從天然藥中提取的抗腫瘤有效成分日益得到人們的重視。天然植物紅豆杉中作為廣譜抗癌的一天然資源，為越來越多腫瘤患者的醫(yī)治帶來福音。但由于這一天然資源的匱乏，植物中有效含量極低，現(xiàn)有提取工藝和制劑使用過程還存在諸多問題，故有必要對存在的問題進行改善及解決。 本文的主要

2、目的就是希望綜合利用紅豆杉中的抗癌活性物，使其生產工藝更符合工業(yè)化生產，在操作中有更好的可行性，更能體現(xiàn)生產簡便、經濟環(huán)保、安全等要求；本文同時還對紅豆杉中的黃酮類化合物還進行了總黃酮富集工藝和細胞藥理實驗的初步研究，并對含量測定的方法學進行了考察，有利于紅豆杉中黃酮化合物的進一步開發(fā)利用。 本論文包括六部分內容，其研究方法、結果如下： 1、綜述 以計算機檢索、手工追溯檢索等手段相結合對國、內外有關紅豆杉研究文獻

3、進行分類綜述，對目前國、內外紅豆杉的主要研究概況加以合理分析，提出課題研究的方向、意義。2、云南紅豆杉中抗癌活性物制備工藝研究方法：利用正交設計試驗L9(3<'4>)確定原料藥提取工藝為：10倍量90％乙醇提取兩次，第一次40分鐘，第二次30分鐘；醇提液用10倍量水沉；沉淀加6倍量石油醚40℃脫脂；用1mol/L 的NaOH溶液堿洗，除去酸性雜質；以堿性氧化鋁柱，以環(huán)己烷/丙酮為洗脫溶劑，在環(huán)己烷-丙酮(6：4)段富集到所需活性部位，洗

4、脫劑用量為3VB。 結果：富集的有效部位各抗癌成分的含量分別為：紫杉醇：9.45％、三尖杉寧堿：9.63％、10-脫乙酰-巴卡亭III：22.64％、總黃酮：19.15％。 3、金松雙黃酮對照品的制備方法：取干燥銀杏葉以95％乙醇超聲提取 3 次，提取液合并，減壓濃縮，石油醚脫脂后，用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮，經硅膠柱(6cm×80cm)層析，石油醚-乙酸乙酯(9：1～5：5)梯度洗脫，產物用甲醇多次沖淋，再以二甲基

5、甲酰氨溶解，反復重結晶，得黃色粉末結晶。 結果：(1)HPLC檢測含量大于95％，符合對照品的要求；(2)理化鑒別實驗均與文獻吻合；(3)紫外、紅外、質譜、核磁共振的光譜結果均與文獻值一致，確定產物為金松雙黃酮。 4．云南紅豆杉枝葉中總黃酮和金松雙黃酮的測定及方法學考察方法：利用高效液相(HPLC)和紫外分光光度法，分別測定云南紅豆杉枝葉中總黃酮和金松雙黃酮的含量。 結果：在波長272nm處測定，云南紅豆杉枝葉中

6、總黃酮的線性范圍為12～28μg/ml，范圍內線性關系良好(r=0.9992)，平均加樣回收率96.04％(RSD為2.7％)，總黃酮的平均含量5.01％；金松雙黃酮的線型范圍為：0.88～4.4μg/ml，進樣量與色譜峰面積呈良好的線性關系(r=0.9999)；平均回收率為95.4％(RSD為3.5％)，平均含量為0.147％(RSD為2.86％)。 5．云南紅豆杉中總黃酮富集工藝的研究方法：(1)確立用超聲法初提藥粉；(2)

7、用L9(3<'4>)正交試驗考察脫脂和醇提的工藝參數(shù)；(3)用大孔樹脂研究總黃酮的富集工藝：考查樹脂類型、上樣液濃度、洗脫曲線等。 結果：優(yōu)化工藝為：以超聲的方法，15倍量石油醚脫脂30min，重復3次；再用6倍量80％乙醇提取，第一次提取2h，第二次提取1.5小時。選用AB-8型大孔樹脂，上樣濃度為6mg/ml，濕法裝柱，先用水洗脫，水的用量定為1.5～2BV；再用20％乙醇洗脫，用量為1.5～2BV；最后用40％乙醇洗脫，用

8、量為1.5～2BV?？傸S酮的含量為51.26％。 6．總黃酮和金松雙黃酮藥理活性的初步研究方法：取金松雙黃酮、總黃酮提取物，總提取物，依次編為藥物1、2、3號并以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，加生理鹽水稀釋至規(guī)定濃度，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃保存。用MTT 法研究各藥物分別對肝癌HePG2細胞、肺癌A549細胞、白血病K562細胞增殖的影響。將藥物配成50、100、150(μg/孔)濃度的溶液。根據測定的吸收度，

9、計算不同濃度藥物對細胞增殖的抑制率，以抑制率為縱坐標，給藥濃度為橫坐標繪制抑制率曲線。 結果：各藥物在不同濃度對細胞增殖均表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制能力：藥物2)藥物1)藥物3；各藥物在中、高濃度時對白血病細胞K562的抑制率均大于50％。 本文結論：通過研究，確定了云南紅豆杉枝葉中抗癌活性物的提取工藝，所用方法簡便、價廉、環(huán)保，為進一步藥理、制劑工作的開展打好了工藝基礎；對云南紅豆杉枝葉中黃酮類成分進行了系統(tǒng)研究，包括