不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細胞TLR4信號通路的變化及其調控機制.pdf

1、背景和目的：炎癥是動脈粥樣硬化和2型糖尿病的共同基礎。冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，2型糖尿病是冠心病的等危癥。不穩(wěn)定性斑塊是導致急性冠脈綜合征（ACS）的病理基礎，而炎癥在斑塊的破裂、血栓形成和局部血管收縮中起極為重要的作用。業(yè)已證明ACS合并2型糖尿病時，冠脈病變嚴重，治療效果差，預后不良，與不伴有糖尿病的患者有明顯的不同，可能與兩者并存時炎癥加重有關。因此研究炎癥及其調控機制在不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病中的作用極為重

2、要。 大量研究表明先天性免疫系統(tǒng)和后天獲得性免疫反應共同參與機體的炎癥反應，而其中模式識別受體在介導先天性免疫中起重要作用，可能是聯(lián)系炎癥與動脈粥樣硬化的橋梁。Toll樣受體（TLRs）是重要的先天免疫模式識別受體，TLR4是TLRs家族中的重要成員，TLR4信號通路的激活介導了眾多炎癥因子的表達。TLR4在動脈粥樣斑塊的內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞和血管外膜成纖維細胞表達均增高，在急性冠脈綜合征患者外周血單核細胞表達增高

3、。另外，TLR4通路激活引起的IKK激活和炎癥因子分泌增加介導了胰島素抵抗的發(fā)生，胰島素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理基礎，但對TLR4在2型糖尿病患者中的表達研究較少且結果不一。我們以往的研究發(fā)現，在不伴有糖尿病的ACS患者外周血單核細胞中，TLR4存在過度激活，單核細胞和轉錄因子NF-κB進一步活化，并產生大量的炎癥因子。TLR4介導的炎癥反應在動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和破裂中可能具有重要作用。但ACS合并2型糖尿病時炎癥反應的

4、加重是否與TLR4過度激活及TLR4信號通路的調控變化有關，尚不清楚。 研究表明，各種內、外源性配體可特異性激活細胞膜上的TLR4受體，進一步通過TLR4/NF-κB信號通路參與炎癥因子的產生和炎癥反應。新近發(fā)現鋅指蛋白A20通過泛素化和去泛素化調節(jié)參與TLR4/NF-κB信號通路的調控，負反饋調節(jié)TLR4信號。A20由各種刺激如TNF-α、LPS等誘導產生，是NF-κB活化的產物，同時又可以負反饋抑制NF-κB的激活，是終止T

5、LR4誘導的NF-κB激活和促炎癥因子表達所必需的。A20在冠心病、糖尿病以及冠心病合并糖尿病中的表達如何，尚不明確。 不穩(wěn)定斑塊中激活的單核巨噬細胞分泌大量的炎癥因子導致斑塊破裂，斑塊中的單核巨噬細胞主要來自血液循環(huán)，故循環(huán)中的單核細胞可反映斑塊中單核細胞狀態(tài)。本研究通過觀察2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者、不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者外周血單核細胞中TLR4、A20及血漿中炎癥因子表達變化，并在離體實驗中觀察以上患者外

6、周血單核細胞TLR4信號通路激活后A20和炎癥因子表達變化，以及轉染A20對該通路的作用。同時觀察高糖對正常人單核細胞TLR4通路的影響及藥物（他汀、厚樸酚）干預作用，探討不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者炎癥反應的發(fā)生和調控機制，為其防治提供理論依據。 方法和結果： 第一部分：實驗對象分為四組：對照組（A組）20例，2型糖尿病組（B組）22例，不穩(wěn)定型心絞痛組（C組）18例，2型糖尿病合并不穩(wěn)定型心絞痛組（D組）19例。

7、取外周血采用流式細胞儀檢測單核細胞TLR4蛋白的表達；分離外周血單核細胞，免疫組化法檢測A20蛋白表達，Real time RT-PCR檢測TLR4mRNA、A20mRNA表達；分離血漿，采用ELISA法檢測血漿中促炎因子TNF-α，和抗炎因子IL-10濃度。結果發(fā)現2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血單核細胞TLR4、A20表達，血漿TNF-α濃度及TNF-α/IL-10顯著高于對照組。不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者上述指標高于

8、單純2型糖尿病患者及單純不穩(wěn)定型心絞痛患者。單核細胞TLR4mRNA和蛋白與FBG、FIN、HOMA-IR、HbAlc、TNF-α、IL-10正相關。 第二部分：（一）實驗對象分為四組：對照組（A組）12例，2型糖尿病組（B組）15例，不穩(wěn)定型心絞痛組（C組）15例，不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病組（D組）15例。分離外周血單核細胞，分別用LPS或PBS刺激單核細胞，用Real time RT-PCR檢測刺激3小時后單核細胞TLR

9、4mRNA、A20mRNA表達，用ELISA法檢測刺激24小時后細胞培養(yǎng)物上清液中TNF-α和IL-10濃度。結果發(fā)現對照組單核細胞受LPS刺激后TLR4、A20表達明顯上調，而不穩(wěn)定型心絞痛患者、2型糖尿病患者及不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細胞LPS刺激后TLR4、A20表達變化無明顯差異。LPS刺激使單核細胞TNF-α、IL-10分泌明顯增高，與對照組相比各實驗組單核細胞分泌TNF-α更多，IL-10較少，TNF-α/IL-

10、10增高。（二）分別將2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者、不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細胞分為空質粒轉染及A20轉染組，轉染48小時后，采用免疫熒光方法檢測GFP報告基因，免疫組化檢測A20蛋白表達，Real time RT-PCR檢測外源性A20mRNA表達。轉染48小時后，予LPS刺激2小時，免疫組化檢測NF-κBp65蛋白表達，予LPS刺激24小時，ELISA法檢測培養(yǎng)上清TNF-α和抗炎因子IL-10濃度。結果發(fā)現A20

11、轉染能降低各實驗組LPS刺激后單核細胞細胞核NF-κBp65表達和細胞培養(yǎng)物上清液中TNF-α濃度，增加培養(yǎng)上清IL-10濃度，使TNF-α/IL-10降低。 第三部分：分離正常人單核細胞，用正常糖、高糖單獨或聯(lián)合阿托伐他汀和厚樸酚刺激48小時。用Real time RT-PCR檢測單核細胞TLR4mRNA、A20mRNA表達，Western blot檢測單核細胞TLR4、A20蛋白表達；用正常糖、高糖單獨或聯(lián)合阿托伐他汀和厚樸

12、酚刺激單核細胞48小時后，再用LPS刺激2小時，用Western blot法檢測NF-κBp65蛋白表達，刺激24小時，用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)物上清液TNF-α和抗炎因子IL-10濃度。結果發(fā)現高糖使單核細胞TLR4mRNA及蛋白、A20mRNA及蛋白表達增高，高糖培養(yǎng)的單核細胞與正常糖培養(yǎng)的單核細胞相比，LPS刺激后細胞核NF-κBp65表達明顯增強，TNF-α分泌增多，IL-10分泌減少。阿托伐他汀、厚樸酚可降低高糖所致的TLR

13、4、A20表達上調，降低高糖作用的單核細胞LPS刺激引起的NF-κBp65表達增加和TNF-α分泌增加，上調抗炎癥因子1L-10的分泌。 結論： （1）不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病存在促炎/抗炎失衡。不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病這種失衡更明顯。 （2）單核細胞TLR4信號通路參與了不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病的炎癥反應，與不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病炎癥反應加重有關。 （3）不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病、不穩(wěn)定型心

14、絞痛合并糖尿病時單核細胞TLR4表達上調，A20上調不足與炎癥反應有關。 （4）增加A20表達可降低不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病、不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病單核細胞TLR4通路過度激活所致的炎癥反應。 （5）高糖可通過增加單核細胞TLR4表達增強TLR4通路介導的炎癥反應。 （6）他汀類藥物可通過降低單核細胞TLR4表達、抑制NF-κB的激活抑制高糖對TLR4信號通路的影響。 （7）中藥厚樸酚可通過降低單核細