雄甾-4-烯-3,17-二酮的11α羥化及人參皂苷Rd微生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本論文包括兩部分內(nèi)容,第一部分為雄甾-4-烯-3,17-二酮的微生物11α羥化研究;第二部分為人參皂苷Rd的微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐制備及分離純化。
　　第一部分雄甾-4-烯-3,17-二酮的微生物11α羥化研究
　　微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有專一性強(qiáng)、污染少和產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn),羥化反應(yīng)是甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中最重要的反應(yīng),微生物能在甾體母核的任何位置進(jìn)行羥化反應(yīng),為甾體藥物的合成提供關(guān)鍵中間體,而化學(xué)方法除了較易在C17引入羥基外,在其它位置都

2、很難引入。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是制備孕激素、皮質(zhì)激素、利尿劑、雄激素和避孕藥等甾體藥物的重要中間體,在其甾體母核引入11-羥基能增強(qiáng)甾體藥物的抗炎活性。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的11α羥基衍生物是制備依普利酮(Eplerenone,商品名Inspra,第一個獲準(zhǔn)上市的選擇性醛固酮受體阻斷劑)的關(guān)鍵中間體。
　　本研究從不同來源的霉菌中篩選得到能在雄甾-4-烯-3,17-二酮上引入11α羥基的菌株Meta

3、rhizium anisopliae M28,并通過紫外誘變獲得一株高轉(zhuǎn)化活性的突變株Metarhizium anisopliae M28-203。本研究對突變株Metarhizium anisopliae M28-203進(jìn)行代謝調(diào)控研究,從營養(yǎng)代謝調(diào)控和轉(zhuǎn)化條件控制兩個方面著手,提高突變株轉(zhuǎn)化效率。培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果表明該突變株培養(yǎng)基最佳配方為葡萄糖3％、玉米漿2％、蠶蛹粉0.5％、硫酸銨0.25％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05

4、％、硫酸亞鐵0.002％。轉(zhuǎn)化條件控制試驗(yàn)表明,該突變株在28～32℃、pH6.0-6.5、菌齡48～60 h、250 mL搖瓶裝液為30ml和40ml、接種量5％和轉(zhuǎn)化時間72 h時能取得最佳轉(zhuǎn)化效果。在底物投料量0.2％(w/v)時,采用4％(v/v)無水乙醇溶解底物或加入0.75 mg/mL Tween80均有利于羥化反應(yīng),在以上優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到62.5％和66.8％。
　　甾體的水不溶性造成投料濃度低(僅0.1％～

5、2％,w/v),轉(zhuǎn)化效率不高。由于有機(jī)溶劑和表面活性劑對菌體的毒性作用,采用無水乙醇和Tween80不能解決投料量的問題。β-環(huán)糊精(CD)是一種外部親水內(nèi)部疏水的籠形分子,能與疏水性分子形成包合物,增加其水溶性。本研究考察了β-環(huán)糊精(CD)對甾體底物在水中的溶解度及菌種羥化反應(yīng)的影響,結(jié)果表明β-環(huán)糊精能顯著提高底物AD在發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解度,增溶效果優(yōu)于有機(jī)溶劑。在底物投料濃度0.2％(w/v)時,與4％無水乙醇投料方式相比,8g

6、/LCD能使AD轉(zhuǎn)化率提高約10％,達(dá)到73.2％,并且使轉(zhuǎn)化時間縮短至60 h左右。說明CD的增溶作用能使底物迅速轉(zhuǎn)移到菌體內(nèi)部與酶接觸,從而提高甾體微生物轉(zhuǎn)化效率。在CD與AD的最佳摩爾比1:1的條件下,能使投料濃度提高至0.3％(w/v)。本研究采用ROESY對CD-AD包合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明甾體母核深入到環(huán)糊精籠形分子空腔內(nèi)部,形成穩(wěn)定的包合物。
　　本研究利用原生質(zhì)體、無細(xì)胞抽提液和酶抑制劑等生物合成機(jī)制研究方法考

7、察了Metarhizium anisopliae M28-203的羥化酶及羥化反應(yīng)機(jī)理。原生質(zhì)體的羥化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明,該菌的羥化酶屬于胞內(nèi)誘導(dǎo)酶,真菌細(xì)胞壁是甾體微生物轉(zhuǎn)化的一個很重要的速率限制因子。原生質(zhì)體的一氧化碳差示光譜顯示在450 nm處有最大吸收峰,結(jié)合無細(xì)胞抽提液的酶抑制試驗(yàn)表明Metarhizium anisopliae M28-203的11α-羥化酶是一種細(xì)胞色素P450依賴的氧化還原酶系統(tǒng),包括細(xì)胞色素P450和NADP

8、H依賴的細(xì)胞色素C還原酶。不同亞細(xì)胞組分的羥化反應(yīng)活性檢測表明,該羥化酶的兩個組成部分細(xì)胞色素P450和NADPH依賴的細(xì)胞色素C還原酶分別處于不同的亞細(xì)胞部位,前者位于微粒體上,后者位于去除微粒體的上清液中,分別起到結(jié)合底物和傳遞電子的作用。
　　本研究獲得了雄甾-4-烯-3,17-二酮的11α-羥化高轉(zhuǎn)化菌種Metarhizium anisopliae M28-203,為制備依普利酮及其他甾體藥物的關(guān)鍵中間體11α-羥基雄甾-

9、4-烯-3,17-二酮提供了一個新的微生物轉(zhuǎn)化方法。β-環(huán)糊精與雄甾-4-烯-3,17-二酮形成包合物的方法為解決困擾甾體工業(yè)化生產(chǎn)的主要問題--甾體的水不溶性提供了有益的參考。對Metarhizium anisopliae M28-203的11α羥化酶和羥化反應(yīng)機(jī)理的探索,為進(jìn)一步分離純化和研究該微生物甾體羥化酶系奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分人參皂苷Rd的微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐制備及分離純化
　　人參皂苷Rd是原人參二醇型稀有人參皂

10、苷,具有多種藥理活性,在野生人參中含量極低。本研究的前期工作是從野山參土樣中分離篩選獲得了高轉(zhuǎn)化活性菌株P(guān)aecilomyces bainier sp.229能轉(zhuǎn)化二醇型人參皂苷Rb1制備稀有人參皂苷compound K,并利用UV-LiC1聯(lián)合誘變對親代菌株進(jìn)行改造,運(yùn)用高濃度人參皂苷定向篩選的方法,得到一株能耐受高濃度底物,并且能專一性轉(zhuǎn)化人參總皂苷中Rbl到人參皂苷Rd的突變株P(guān)aecilomyces bainier sp.229

11、-7。前期研究在搖瓶發(fā)酵條件下對Paecilomyces bainiet sp.229-7的發(fā)酵培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,對突變株P(guān)aecilomyces bainiev sp.229-7轉(zhuǎn)化人參總皂苷為人參皂苷Rd的10 L發(fā)酵罐制備進(jìn)行研究,進(jìn)一步證實(shí)突變株P(guān)aecilomyces bainier sp.229-7能專一性的將三七莖葉總皂苷中的Rbl轉(zhuǎn)化為Rd,并且具有高的底物耐受性。10 L

12、發(fā)酵罐裝液量為6 L,投料濃度2％(w/v)時,通過控制溶氧、轉(zhuǎn)速、pH和溫度等,克分子轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到88.9％。
　　本研究首次采用大孔樹脂對發(fā)酵液中的人參皂苷Rd進(jìn)行分離純化,通過大孔樹脂HP20粗分、脫水及大孔樹脂H41精制后,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物人參皂苷Rd純度可以達(dá)到93％左右,回收率55％以上。利用大孔樹脂從發(fā)酵液中分離純化人參皂苷:Rd方法的建立將有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。
　　Paecilomyces bamier sp.22