轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細胞絮凝的研究.pdf

1、微藻可以用于CO2減排、污水處理和生物能源生產(chǎn)，對社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。但由于微藻細胞個體小，表面攜帶電荷以及培養(yǎng)濃度低等特點，使得微藻采收成本高居不下。理想的微藻不但應(yīng)有良好的經(jīng)濟價值，最好還具有細胞絮凝能力，利用其細胞絮凝特性進行采收，會大大降低采收成本。
　　斜生柵藻不但可以作為飼料餌料，也可用于水體修復(fù)，還可用于生物柴油生產(chǎn)。但目前國內(nèi)外對其分子生物學和遺傳學研究還很少，缺少高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。本文以斜生柵藻FS

2、P-3為實驗材料，建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，實現(xiàn)了酵母絮凝基因的成功表達，并證明了酵母絮凝基因可賦予柵藻細胞絮凝的特性。此外，還研究了天然自絮凝柵藻AS-6-1的細胞自絮凝特性，探討了細胞自絮凝機理，研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　首先，對實驗藻株進行無菌處理，這是進行微藻生理、生化以及遺傳學研究的關(guān)鍵和前提。通過離心洗滌和稀釋平板法除去藻液中的霉菌，再利用溶菌酶/SDS并結(jié)合抗生素法除藻液中的細菌，通過鏡檢及無菌檢驗，未見有細菌或霉菌存

3、在，證明有效地去除了斜生柵藻FSP-3和AS-6-1中的雜菌，為后續(xù)研究工作提供了可靠的實驗材料。在此基礎(chǔ)上，對獲得的無菌藻株進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，分別考察了接種量、溫度、表面光照強度及初始pH對藻細胞生長的影響。斜生柵藻FSP-3的最適培養(yǎng)條件為1×106cells/mL的接種量，28℃培養(yǎng)，6000 lx的光照強度和初始pH為6.0-6.5;而斜生柵藻AS-6-1最適合生長的培養(yǎng)條件為:1×106 cells/mL的接種量，30℃培養(yǎng)

4、，6000lx的光照強度和pH為6.5的初始pH。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，斜生柵藻FSP-3和AS-6-1的生長情況均得到了明顯的改善，不但生物量積累增加，而且多糖、蛋白質(zhì)、總脂等胞內(nèi)組分的含量也顯著地提高。
　　以游離斜生柵藻FSP-3細胞為受體，采用電擊法將含有CaMV35S啟動子、報告基因gfp、選擇標記基因cat的載體pCAMB IA1302-CAT導入藻細胞中，并對電擊轉(zhuǎn)化的相關(guān)參數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明在質(zhì)粒濃度為50μg/

5、mL，滲透液濃度為0.2 mol/L，脈沖時間為2 ms，脈沖電壓為2 kV的條件對斜生柵藻FSP-3進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率高達494±48/106受體細胞，而且轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定傳代10個月，得到的轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性是目前微藻遺傳轉(zhuǎn)化研究中較高水平。進而，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀分別定性和定量檢測報告基因gfp在轉(zhuǎn)化子中的表達，證明所選用的載體元件包括啟動子CaMV35S、報告基因gfp、選擇標記基因cat在斜生柵藻FSP-3遺傳轉(zhuǎn)化體系

6、中均有效可用。同時采用PCR，Southern blot以及RT-PCR方法對轉(zhuǎn)化子進行了分析，從DNA和RNA水平上證明了載體pCAMBIA1302-CAT成功地導入斜生柵藻FSP-3細胞中，并將T-Border之間的區(qū)域隨機整合到柵藻FSP-3基因組中。由此建立了斜生柵藻FSP-3高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并為外源基因的導入奠定基礎(chǔ)。
　　將含有酵母絮凝基因FLO1的表達載體pCAMBIA1302-CAT-FLO1導入斜生柵藻F

7、SP-3細胞中，篩選得到具有絮凝性狀的陽性轉(zhuǎn)化子，并通過熒光顯微鏡和掃描電鏡從細胞水平上觀察到由于酵母絮凝基因FLO1的導入，引起了藻細胞絮凝的現(xiàn)象。利用PCR、RT-PCR對轉(zhuǎn)化子進行了分析，證明了酵母絮凝基因FLO1成功導入斜生柵藻FSP-3細胞中并進行了有效地表達，從而賦予了轉(zhuǎn)化子細胞絮凝的特性。通過轉(zhuǎn)基因藻株與野生型藻株的生長代謝情況進行研究，發(fā)現(xiàn)外源基因的導入表達對柵藻細胞生長的并不顯著。由此證明酵母的絮凝基因可在微藻中進行表

8、達，并賦予微藻自絮凝性狀。
　　通過比較天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1和轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻FSP-3-FLO1，發(fā)現(xiàn)二者絮凝形態(tài)和絮凝性能存在較大差異:轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝顆粒較大，表現(xiàn)出良好的自沉降性能，而天然絮凝微藻AS-6-1對淡水游離藻柵藻FSP-3和小球藻CNW-11具有良好的絮凝沉降能力。另外，天然自絮凝藻AS-6-1絮凝性能具有良好的溫度耐受性和pH穩(wěn)定性，而且不受金屬離子螯合劑EDTA和糖的影響，具

9、體原因與其絮凝活性物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝性能表現(xiàn)出高溫和pH的敏感性，被EDTA、蛋白酶K解絮以及被甘露糖、半乳糖抑制的現(xiàn)象，其原因歸結(jié)為轉(zhuǎn)基因柵藻FSP-3-FLO1的絮凝性狀是由于表達了外源酵母絮凝蛋白而引起的，絮凝蛋白的穩(wěn)定性和活性直接影響了其細胞絮凝的性狀。
　　研究表明天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1的絮凝活性物質(zhì)是多糖，其中中性糖、酸性糖和氨基糖的質(zhì)量分數(shù)比為16∶9∶1，單糖組成中較高的甘