基于DNAzymes構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器檢測生物小分子.pdf

1、生物傳感器是由生物、醫(yī)學(xué)、物理、化學(xué)、電子技術(shù)等多種學(xué)科相互滲透形成的新的研究領(lǐng)域。生物傳感器在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和食品工業(yè)等方面都有重要應(yīng)用，并以其體積小、特異性好、靈敏度高、檢測快速方便、檢測成本低和容易實現(xiàn)實時在線活體檢測等優(yōu)點，成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點之一。近年來新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學(xué)研究和實際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善，使生物分子檢測的靈敏度和特異性都得到很大的提高。然而隨著疾病診斷要求的不斷提高與科學(xué)研究的不斷深

2、入，迫切需要發(fā)展一些靈敏度高、選擇性好、操作簡單且成本低廉的生物傳感器以便更好地滿足科學(xué)研究和實際應(yīng)用的需求。
　　本研究主要利用核酸酶(DNAzymes)的自剪切特性以及核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ的性質(zhì)來循環(huán)放大電化學(xué)檢測信號，從而提高新設(shè)計的生物傳感器的靈敏度;通過借助T4 DNA連接酶對其輔因子的高度依賴性以及核酸酶(DNAzymes)對其催化自剪切輔因子的特異性識別能力來提高新設(shè)計的生物傳感器的選擇性。
　　本研

3、究的主要內(nèi)容如下:
　　(1)基于酶連接反應(yīng)和自剪切核酸酶信號放大雙重策略構(gòu)建新型電化學(xué)生物傳感器。討論了基于輔因子ATP依賴性的酶連接反應(yīng)和自剪切核酸酶(8-17DNAzyme)信號放大雙重策略設(shè)計的電化學(xué)生物傳感器對于目標(biāo)分子三磷酸腺苷(ATP)的檢測效果。連接反應(yīng)生成的活性8-17 DNAzyme在Zn2+存在時，能夠剪切與其雜交的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA基底，使標(biāo)記了亞甲藍(lán)的基底片段離開金電極表面，從而產(chǎn)生可檢測的電化學(xué)信號。由于T

4、4 DNA連接酶對輔因子ATP具有高度的特異性，當(dāng)檢測系統(tǒng)中不存在目標(biāo)分子ATP時，兩段獨(dú)立的DNA片段不能被連接成一條完整的8-17 DNAzyme序列，后續(xù)的自剪切催化反應(yīng)就不能發(fā)生。因此，此傳感器對ATP的響應(yīng)具有高度的選擇性。連接反應(yīng)產(chǎn)生的8-17 DNAzyme能夠循環(huán)放大自剪切所產(chǎn)生的電化學(xué)信號變化，增強(qiáng)傳感系統(tǒng)的靈敏度，使得此傳感器對于ATP的檢測限達(dá)到0.053 nM(S/N=3)。
　　(2)基于特異性DNAzy

5、me和核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ構(gòu)建新型電化學(xué)生物傳感器。主要討論了基于特異性DNAzyme和核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ信號放大雙重策略構(gòu)建的新型電化學(xué)生物傳感器對于目標(biāo)分子L-組氨酸的檢測效果。當(dāng)體系中存在目標(biāo)分子L-組氨酸時，L-組氨酸依賴性的DNAzyme則在其腺嘌呤核糖核苷酸(rA)酶切位點發(fā)生相應(yīng)的自剪切催化反應(yīng)，導(dǎo)致DNAzyme在rA酶切位點處發(fā)生斷裂，因而游離出一段DNAzyme殘片與固定在金電極表面的HP-Fc

6、DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，在電極表面形成能被核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ特異性識別的DNA雙鏈。當(dāng)體系中加入核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ時，在其特異性識別序列的酶切位點處就會發(fā)生催化剪切反應(yīng)，使HP-Fc DNA發(fā)生斷裂，導(dǎo)致標(biāo)記有二茂鐵的DNA碎片從電極表面游離出去，從而產(chǎn)生可檢測的電化學(xué)信號。由于此DNAzyme對其輔因子L-組氨酸具有高度的依賴性，所以此傳感系統(tǒng)對目標(biāo)分子L-組氨酸的檢測具有超高的選擇性。核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNB

7、Ⅰ參與的酶切反應(yīng)過程能夠進(jìn)行多圈循環(huán)，產(chǎn)生循環(huán)放大電化學(xué)檢測信號的效果，增強(qiáng)檢測系統(tǒng)的靈敏度，使得此傳感器對于L-組氨酸的檢測限達(dá)到360 nM(S/N=3)。
　　(3)基于DNAzyme、核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ、標(biāo)記的短鏈DNA探針構(gòu)建signal-on型電化學(xué)生物傳感器。主要討論了基于特異性DNAzyme、核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ、亞甲藍(lán)標(biāo)記的短鏈DNA探針構(gòu)建的signal-on型電化學(xué)生物傳感器對于目標(biāo)分子

8、L-組氨酸的定量檢測效果。為了提高傳感器對于目標(biāo)分子L組氨酸檢測的靈敏度，在同類型的signal-off傳感系統(tǒng)中加入亞甲藍(lán)標(biāo)記的短鏈DNA探針，從而將其改進(jìn)為一個新型的signal-on型電化學(xué)生物傳感器。改進(jìn)后的傳感器對L組氨酸響應(yīng)的線性范圍為5.0×10-7-1.0×10-3 M(線性相關(guān)系數(shù)為0.995)，檢測限達(dá)到0.21μM(S/N=3)。與之前報道的文獻(xiàn)相比，這個新型的signal-on型電化學(xué)生物傳感器在一定程度上提高了