基于納米材料和環(huán)介導等溫擴增技術的電化學生物傳感器的研究.pdf

1、在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析和病原微生物研究等領域，快速、簡單、靈敏的實現(xiàn)生物分子的檢測，是目前分析化學中極具吸引力的熱門研究課題之一。電化學生物傳感器由于其簡單、成本低、靈敏度高和易于微型化等優(yōu)勢在生物分子檢測上得到了大力的開發(fā)和研究。關注電化學生物傳感器中的新方法和新技術，利用多種特異性好的分子識別元件，結合性能優(yōu)異的各種新型納米材料，引入有效的信號放大策略，對提高電化學生物傳感器的各項性能，實現(xiàn)對各種生物分子特異靈敏的檢測具有十

2、分重要的意義。本論文基于多種放大策略，結合功能化納米材料和環(huán)介導等溫擴增技術，在研發(fā)成本低、實用性強、操作簡便的高靈敏生物傳感器上做了以下工作：
　　1.卟啉錳-DNA雙鏈復合物引導聚苯胺原位沉積用于凝血酶的電化學檢測
　　有文獻報稱卟啉錳-DNA雙鏈復合物（MnTMPyP-dsDNA）是一類優(yōu)異的過氧化物模擬酶，但是到目前為止，以MnTMPyP-dsDNA為催化劑催化苯胺聚合為聚苯胺（PANI）的文獻還鮮有報道。本實驗提出

3、以有過氧化物模擬酶作用的MnTMPyP-dsDNA復合物為有效的催化劑和模板，在電極表面原位催化生成PANI為電化學活性物質，構建電化學傳感器用于凝血酶（TB）的靈敏檢測。在構建的“夾心型”適體傳感器上，高密度的MnTMPyP-dsDNA催化單元能夠催化苯胺氧化形成聚苯胺，從而產生一個可測量的電化學信號。為了進一步放大電流信號，聚多巴胺和納米金功能化的Pd@Pt合金納米籠被用作納米載體用于增強生物分子的固載量，為電子轉移提供良好的微環(huán)境

4、。因此，擁有免標記、良好催化性能和穩(wěn)定性的MnTMPyP-dsDNA復合物，結合納米材料顯著的信號放大能力，所構建的傳感器在0.5 pmol/L~30 nmol/L濃度范圍內對凝血酶表現(xiàn)出了良好的線性響應，檢測限達0.14 pmol/L。
　　2.基于多功能的卟啉鐵摻雜金屬有機框架材料構建的電化學凝血酶適體傳感器
　　通過將卟啉鐵（hemin）摻雜到納米粒徑的Fe-MIL-88金屬有機框架材料中，合成了一種新型的多功能金屬有

5、機框架材料（hemin@MOFs），并且在酶輔助信號放大的作用下首次將其用于構建電化學凝血酶適體傳感器。納米金功能化的hemin@MOFs材料（Au/hemin@MOFs）不僅同時可作為電化學活性物質和固態(tài)的電化學催化劑，還可以被用作于理想的固載平臺，固載大量的生物分子。在構建的適體傳感器中，葡萄糖氧化酶（GOD）和凝血酶第二適體鏈（TBA II）固載于Au/hemin@MOFs納米材料上形成第二適體耦合物（Au/hemin@MOFs-

6、TBA II-GOD耦合物）。凝血酶夾心于Au/hemin@MOFs-TBA II-GOD耦合物和組裝在電極表面的凝血酶第一適體鏈之間。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖轉化為葡萄糖酸并伴隨著H2O2的生成。在電極表面所產生的H2O2被hemin@MOFs進一步催化還原，以放大hemin@MOFs自身包含的hemin的電化學信號。因此，所合成的hemin@MOFs集催化劑，電化學活性物質和固載平臺三種不同功能于一體，可作為多功能材料的典范。通過這樣

7、的巧妙設計，該適體傳感器在凝血酶濃度為0.1 pmol/L～30 nmol/L范圍內有良好的線性響應，檢測限達0.068 pmol/L。
　　3.基于β-環(huán)糊精-二茂鐵主客體識別作用的多肽電化學生物傳感器的研究
　　我們通過聯(lián)合二茂鐵（Fc）與β-環(huán)糊精（β-CD）的主客體識別作用發(fā)展了一種“信號增強型”（signal-on）的基于多肽剪切的分析方法用于靈敏特異地檢測前列腺特異性抗原（PSA）。首先，將一段標記了氧化還原探針

8、二茂鐵（Fc）的能夠被 PSA特異性識別剪切的多肽（Fc-peptide）組裝于金包四氧化三鐵磁珠（Fe3O4@Au）表面，在目標物存在的條件下，PSA能夠特異性的剪切多肽，帶有多肽碎片的氧化還原探針Fc就會從Fe3O4@Au表面釋放到溶液中。固載在電極表面的β-CD分子能夠將釋放到溶液中的Fc通過主客體識別作用捕獲到電極表面，從而產生電化學信號用于PSA的定量檢測。另外，采用碳納米管-樹枝狀聚氨基胺納米雜化材料（CNTs-PAMAM）

9、用于傳感器敏感界面的構建，不僅能夠增加β-CD的固載量用于捕獲剪切釋放的Fc，而且還能促進Fc與電極之間的電子傳遞。通過多肽剪切與主客體識別作用相結合，這個工作提供了一種簡單的、高靈敏、高特異性的PSA檢測方法。該傳感器線性范圍為0.001~30 ng/mL，檢測限為0.78 pg/mL。
　　4. pH計結合環(huán)介導等溫擴增技術用于家蠶微孢子蟲基因DNA PTP1檢測的研究
　　近年來，環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是一種新興的

10、微生物疾病快速診斷的早期檢測和識別工具。目前，LAMP擴增產物的檢測技術主要是基于擴增產物的凝膠電泳，焦磷酸鎂的濁度，金屬離子的阻抗以及電化學試劑的電化學信號，但是這些技術由于對大型昂貴實驗儀器的依賴或不能實現(xiàn)定量檢測等缺點而不被公眾所廣泛接受。這里，我們提出一種通過使用pH計直接測量LAMP擴增過程中釋放的氫離子的集放大和測定于一體的檢測方法。并且首次將這種LAMP-pH計策略用于家蠶微孢子蟲的基因DNA的檢測。這種方法的核心概念是用

11、pH計將LAMP擴增過程中由于核酸聚合反應產生的氫離子引起的pH的變化，以可靠的信號輸出方式記錄下來，通過pH的變化值間接反映核酸的擴增程度。通過這個平臺，可以檢測到0.5 pg/μL的家蠶微孢子蟲的基因DNA。此外，該方法簡單、有效，將有望推廣于不發(fā)達國家的農民使用。
　　5.追蹤環(huán)介導等溫擴增中產生的磷酸根離子用于電化學檢測家蠶微孢子蟲基因DNA PTP1
　　通常情況下，環(huán)介導等溫擴增（LAMP）中擴增出的DNA檢測都

12、是基于復雜的凝膠電泳或昂貴的熒光方法。在本文中，與傳統(tǒng)的直接檢測擴增DNA的方法不同，我們通過電化學的方法間接追蹤LAMP中產生的磷酸根離子（Pi）實現(xiàn)核酸的高靈敏檢測。焦磷酸根離子（PPi）作為LAMP中核酸聚合反應的副產物，被預先加入的耐高溫無機焦磷酸酶（PPase）水解成Pi。因此LAMP擴增反應中總的Pi的量是與加入的初始目標DNA模板成比例的。水解得到的Pi可以與酸性鉬酸鹽反應，在電極表面形成可直接作為電化學活性物質，給出易測