滑膜細胞微環(huán)境對軟骨細胞生物學活性的影響.pdf

1、骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種好發(fā)于中老年人的慢性進行性骨關節(jié)病。它是一種以軟骨退行性變?yōu)楹诵?，累及骨質(zhì)，包括滑膜，關節(jié)囊及關節(jié)囊外其他結(jié)構(gòu)的不同程度的炎性病變。隨著我國人口老齡化和OA發(fā)病趨勢年輕化，OA逐漸成為危害人類健康和生存質(zhì)量的重要疾病。對OA發(fā)生和發(fā)展機制的研究也已成為骨科領域研究的重點。研究顯示無論何種原因引發(fā)的OA多伴有關節(jié)內(nèi)微環(huán)境失衡，滑膜及其細胞是其主要因素。
　　 目的：建立滑膜細胞

2、與軟骨細胞共培養(yǎng)體系，構(gòu)筑類OA微環(huán)境，探討滑膜細胞在OA發(fā)生中的作用，為OA發(fā)病機理研究提供依據(jù)。
　　 方法：⑴采用改良的Hulth法復制兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，術(shù)后4周關節(jié)腫脹、滑膜增生明顯，獲得大量滑膜組織。⑵用胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法分離滑膜細胞進行原代與傳代培養(yǎng)，觀察滑膜細胞形態(tài)、活性，進行CD68免疫組化鑒定。⑶采用兩步酶消化法從正常兔膝關節(jié)軟骨組織獲取軟骨細胞，

3、進行原代、傳代培養(yǎng)及細胞學觀察；⑷建立滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系，將原代和傳代滑膜細胞分別以不同的比例(1:1，1:1/2，1:1/4，1:1/8)分別與軟骨細胞(細胞數(shù)為4×104個)共培養(yǎng)，以正常軟骨細胞組為對照組，觀察原代及傳代滑膜細胞微環(huán)境對軟骨細胞形態(tài)及生物學活性的影響。⑸采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測共培養(yǎng)10

4、天和20天時原代及傳代滑膜細胞微環(huán)境對各組軟骨細胞在RNA水平上，Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達的影響。
　　 結(jié)果：①改良Hulth法復制膝骨性關節(jié)炎模型，造模4周關節(jié)腫脹，滑膜組織增生明顯，襯覆滑膜細胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，軟骨表面裂隙或纖維化，軟骨細胞呈小灶性壞死。②胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法可培養(yǎng)獲得大量滑膜細胞且細胞活性大于98％，巨噬細胞樣滑膜細胞CD68免疫組化染色陽性。③胰蛋白酶-Ⅰ型膠原酶-Ⅱ型膠原酶聯(lián)

5、合酶消化法可成功分離并獲得大量高活性軟骨細胞。④以滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系構(gòu)筑了滑膜細胞微環(huán)境，滑膜細胞數(shù)量、培養(yǎng)時間與軟骨細胞形態(tài)及增殖活性密切相關，滑膜細胞數(shù)量越多、作用時間越長，軟骨細胞增殖活性越低。⑤滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系中，滑膜細胞數(shù)量、代次與Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達密切相關。共培養(yǎng)的軟骨細胞基因表達明顯下調(diào)，原代滑膜細胞作用強于傳代滑膜細胞；滑膜細胞數(shù)量越高，軟骨細胞基因表達越低。
　　 結(jié)論：⑴改良Hu

6、lth造模法可迅速形成骨性關節(jié)炎，使滑膜組織在短時間內(nèi)增生明顯，襯覆滑膜細胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，獲得大量的滑膜組織，解決了滑膜取材難的問題。該法適用于提取滑膜組織和OA發(fā)病機制的研究。⑵聯(lián)合酶消化法可分離獲取滑膜細胞、軟骨細胞，實驗操作簡單、快捷，細胞貼壁快且細胞活性率較高，可在短時間內(nèi)為實驗研究提供大量目標細胞，為實驗的進一步研究提供了方便。⑶構(gòu)筑的滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系適用于OA微環(huán)境的研究，且該體系可模擬類OA關節(jié)內(nèi)