EN2基因沉默對人腎小管上皮細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：探討沉默EN2對人腎小管上皮細胞（HK-2細胞株）生物學行為的影響。
　　方法：利用慢病毒載體介導沉默人腎小管上皮細胞HK-2細胞株EN2基因的表達，轉染并篩選穩(wěn)定低表達EN2基因的人腎小管上皮細胞HK-2細胞株，以Lv-shEN2為實驗組、Lv-shcon為空載組、control為空白對照組。RT-qPCR和Western blot分別檢測EN2 mRNA和蛋白的表達水平，MTT檢測HK-2細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞

2、周期和凋亡，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。
　　結果：設計與EN2互補的DNA序列，合成shRNA-EN2并克隆到慢病毒載體，同時設計非特異性shRNA生成的載體作為陰性對照。轉染HK-2細胞后，篩選獲得穩(wěn)定低表達EN2基因的HK-2細胞株。RT-qPCR分析顯示 EN2mRNA在 Lv-shcon組2(-ΔΔCt)=1.07±0.07,control組2(-ΔΔCt)=1±0.14中的表達

3、分別是 Lv-shEN2組2(-ΔΔCt)=0.58±0.02的1.9倍和1.7倍。Western Blot檢測各組灰度值Lv-shEN2組2576.65。Lv-shcon組1619.26，control組1478.85。提示轉染成功。
　　MTT法分析結果采用單因素方差分析顯示三組細胞OD值差別（F=4.78。P=0.01）有統(tǒng)計學意義。與兩對照組細胞比較，Lv-shEN2組細胞OD值升高，提示抑制EN2蛋白可促進人腎小管上皮細

4、胞HK-2細胞的增殖活性。
　　流式細胞儀檢測顯示Lv-shEN2組相對于兩對照組，細胞凋亡率下降。Lv-shEN2實驗組、Lv-shcon空載組、control空白對照組HK-2細胞凋亡比例分別為9.79％，24.98%和24.9%。與兩對照組細胞比較，Lv-shEN2組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均下降，提示抑制EN2基因表達可減少HK-2細胞凋亡。
　　細胞穿膜實驗顯示Lv-shEN2實驗組、Lv-shcon空載組、co

5、ntrol空白對照組HK-2細胞穿膜細胞數(shù)分別為18.5±5.62，0.5±1.12和0.5±0.76，單因素方差分析顯示Lv-shEN2實驗組穿膜細胞數(shù)與兩對照組之間不同（F=19.35。P=0.00），說明下調(diào)EN2蛋白可提高人腎小管上皮細胞HK-2的侵襲能力。
　　細胞劃痕試驗各組0h，6h，12h和24h劃痕寬度采用單因素方差分析，結果顯示各組細胞遷移能力差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：下調(diào)HK-2細胞