Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的功能研究.pdf

1、第一部分:Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的功能研究
　　血管穩(wěn)態(tài)維持是機(jī)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。血管為機(jī)體組織供應(yīng)氧和營養(yǎng)物質(zhì)，以及將其產(chǎn)生的代謝廢物排出體外。目前，血管疾病已成為危害人類健康的重要?dú)⑹?，如何提高血管疾病的診斷及預(yù)防已成為當(dāng)今人類急切需要解決的社會(huì)及科學(xué)問題。而這些疾病的病理基礎(chǔ)都是血管結(jié)構(gòu)及血管功能的異常。因此，闡明生理狀態(tài)下血管結(jié)構(gòu)、血管功能的調(diào)控機(jī)制以及血管疾病的發(fā)病機(jī)制將為血管疾病以及以血管病變?yōu)榛A(chǔ)的其他諸多疾病的

2、預(yù)防與診斷提供理論基礎(chǔ)。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多重要的相關(guān)基因及相關(guān)的分子機(jī)制參與血管疾病的調(diào)控。但還有待更深入的研究，因此發(fā)現(xiàn)血管疾病的調(diào)控基因，為血管疾病的診斷和治療提供新靶標(biāo)，將有很重要的意義。
　　鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1A（Protein phosphatase,magnesium-dependent1A，PPM1A）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PPM家族的成員,具有鎂離子或錳離子依賴性的單體磷酸酶。Ppm1a的底物廣泛，能與

3、眾多蛋白結(jié)合使其去磷酸化，從而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路參與對血管發(fā)育及血管穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控，并在其中發(fā)揮著重要功能。許多TGF-β信號通路成員，無論是配體Tgfβ1，受體Tgfβr2、Alk1、Alk5等，還是胞內(nèi)信號介導(dǎo)者Smads，其敲除小鼠都表現(xiàn)出嚴(yán)重血管發(fā)育缺陷。雖然遺傳修飾小鼠的研究指出TGF-β信號通路的阻斷會(huì)導(dǎo)致小鼠在胚胎期血管出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷。然

4、而TGF-β信號水平被過度激活后，其在血管中的功能研究以及相關(guān)的小鼠模型仍然有所欠缺。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道可知，Ppm1a是TGF-β信號通路的負(fù)調(diào)控因子， Ppm1a作為蛋白磷酸酶能使P38去磷酸化抑制TGF-β信號，也能通過去磷酸化Smad2/3抑制TGF-β信號。此外，Ppm1a降低Smad蛋白水平抑制骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）信號。那么，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性敲除Ppm1a是否能過度激活

5、TGF-β信號Ppm1a在血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否具有功能？本項(xiàng)研究通過對內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除的Ppm1a小鼠的表型分析，探索Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能以及其分子機(jī)制。
　　利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的內(nèi)皮細(xì)胞特異性的Tie-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Ppm1a條件基因打靶小鼠交配，獲得內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除的Ppm1a小鼠。接下來，我們對內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠進(jìn)行表型分析。通過對突變小鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)其能正常出生并存活。并對突變小鼠胚胎期的血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行

6、分析，發(fā)現(xiàn)并無明顯異常。接著，我們對兩月齡的突變小鼠的腦、主動(dòng)脈、腎、肺等進(jìn)行組織切片觀察，結(jié)果顯示與對照小鼠相比，成年條件敲除小鼠的血管結(jié)構(gòu)也沒有發(fā)生明顯異常。
　　內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合粘蛋白Endomucin是一種糖蛋白，被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。以往的研究表明，Endomucin主要表達(dá)在小鼠胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞、成體的靜脈及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在成體主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中并不表達(dá)。Endomucin具有一些生理功能，如在正常狀態(tài)下，End

7、omucin能抑制中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而維持血管的穩(wěn)態(tài)。而在炎癥狀態(tài)下，Endomucin的低表達(dá)能促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。通過對成體小鼠的腦、主動(dòng)脈、腎、肝、心臟、肺等進(jìn)行Endomucin免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮Endomucin表達(dá)顯著增強(qiáng)。我們進(jìn)一步對不同時(shí)間段的突變小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈內(nèi)膜Endomucin檢測，發(fā)現(xiàn)出生后七天的條件基因敲除小鼠主動(dòng)脈Endomucin同對照小鼠一樣不表達(dá)

8、。而出生一個(gè)月以后的突變小鼠，其主動(dòng)脈內(nèi)膜Endomucin持續(xù)表達(dá)。說明內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Endomucin是獲得性表達(dá)。進(jìn)一步我們利用免疫組化實(shí)驗(yàn)，對TGF-β信號通路中一些重要分子的活化水平進(jìn)行檢測。我們發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，條件基因敲除小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜磷酸化Smad1/5/8的表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果提供體內(nèi)證據(jù)表明Ppm1a可以負(fù)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞Smad1/5/8的活化。Smad1/5/8活化與Endomucin獲得性表

9、達(dá)具有怎樣的相關(guān)性，以及Endomucin的獲得性表達(dá)具有怎樣的生理意義尚有待進(jìn)一步研究。
　　根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道可知，TGF-β信號異常激活促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。我們進(jìn)一步檢測了內(nèi)皮 Ppm1a敲除小鼠的腎、肺、主動(dòng)脈、腦等組織是否發(fā)生了內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。通過Masson染色實(shí)驗(yàn)，與對照小鼠相比，內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠并沒發(fā)生明顯的纖維化，提示內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠無明顯的內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生。此外，我們對敲除小鼠進(jìn)行低氧

10、低壓應(yīng)激誘導(dǎo)處理，與上述結(jié)果一致，經(jīng)低氧低壓處理的突變小鼠也無內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生。
　　血腦屏障作為腦血管特化屏障結(jié)構(gòu)，能夠精確控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血中各種物質(zhì)的進(jìn)出，從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的高度穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。TGF-β信號通路在血腦屏障的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。我們檢測了正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞Ppm1a突變小鼠血腦屏障是否發(fā)生滲漏，與對照小鼠相比，突變小鼠在正常下并無血腦屏障的

11、滲漏。而根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道可知，缺氧是眾多腦血管疾病的根源，其主要是影響腦組織的血腦屏障。因此，我們也檢測了在低氧低壓應(yīng)激誘導(dǎo)處理后的內(nèi)皮Ppm1a敲除小鼠血腦屏障的滲漏情況，發(fā)現(xiàn)低氧低壓應(yīng)激誘導(dǎo)處理后內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的血腦屏障完整性與對照小鼠相比并無明顯異常。綜上所述，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Ppm1a，對成體重要器官包括腦、腎、肝、心臟等的血管結(jié)構(gòu)無顯著影響。但能使主動(dòng)脈中內(nèi)皮細(xì)胞Endomucin獲得性表達(dá)，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞磷酸

12、化Smad1/5/8表達(dá)上調(diào)。本研究首次系統(tǒng)闡述內(nèi)皮細(xì)胞Ppm1a在血管發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能，為血管發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制的新認(rèn)識提供遺傳學(xué)依據(jù)。
　　第二部分:腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β以Smad4依賴的方式上調(diào)Notch4
　　轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路與Notch信號通路在血管發(fā)育以及血管疾病的發(fā)生過程中起重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中，TGF-β信號通路與

13、Notch信號通路的相互作用已被報(bào)道。此外，以往的研究發(fā)現(xiàn)在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中通過TGF-β/Smad4與Notch信號通路的協(xié)同作用來維持血管的完整。之前，我們發(fā)現(xiàn)在Smad4缺損的內(nèi)皮細(xì)胞中，Notch信號明顯下調(diào)。然而，Notch受體是否作為TGF-β/Smad4信號通路下游靶分子而被TGF-β/Smad4直接調(diào)節(jié)，至今未見報(bào)道。在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1和骨形成蛋白4（Bone morphogenetic protein4