以減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌為載體的腸出血性大腸桿菌EHEC O157：H7疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的 O157：H7是腸出血性大腸桿菌的一個(gè)主要血清型(本文簡(jiǎn)稱(chēng)為O157)，感染該菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎、也可引發(fā)溶血性尿毒綜合征及血小板減少性紫癜等并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。自1982年被確定為致病菌的20多年間，世界各地已發(fā)生了多起O157的暴發(fā)流行，表明O157的感染已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。然而目前缺乏有效的防治方法，研究證實(shí)抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)，從而使患者并發(fā)溶血性

2、尿毒綜合癥的危險(xiǎn)性增加，因此，研制O157疫苗對(duì)預(yù)防和控制O157感染有著極其重大的意義。 EspA(大腸桿菌分泌蛋白A)、IntiminC300(緊密粘附素Intimin C端片段約1/3部分)和Stx2B(志賀毒素2 B亞單位)都是O157重要的保護(hù)性抗原。EspA作為O157 Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要元件，在O157感染引起的宿主細(xì)胞A/E(attaching/effacing)損傷過(guò)程中起重要的橋梁作用。人和動(dòng)物感染O157后

3、，機(jī)體可產(chǎn)生高水平的EspA抗體。緊密粘附素(Intimin)介導(dǎo)細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞的緊密粘附，是O157最主要的定植因子，尤其是它的C端約1/3部分(Intimin-c)為胞外功能區(qū)，可與相應(yīng)受體結(jié)合，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性。Stx2是O157致溶血性尿毒綜合征的一個(gè)主要毒素，其中B亞單位(Stx2B)具有細(xì)胞結(jié)合的特性，表現(xiàn)出良好的免疫原性，而針對(duì)Stx2B的單克隆抗體具阻斷毒素的作用。 減毒沙門(mén)氏菌因?yàn)槟軌蛲ㄟ^(guò)粘附、

4、侵襲、定居在腸道相關(guān)淋巴組織，已被證實(shí)為有效的粘膜免疫載體工具，可經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)到達(dá)肝臟、脾臟，進(jìn)一步有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。特別是近來(lái)利用不以抗生素作為選擇壓力的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建的減毒沙門(mén)氏菌載體疫苗已顯示出良好的應(yīng)用前景。 因此本實(shí)驗(yàn)利用pYA3 149的載體一宿主平衡致死系統(tǒng)表達(dá)O157的EspA及其IntiminC300、Stx2B的融合保護(hù)性抗原，構(gòu)建以減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌為載體的腸出血性大

5、腸桿菌O157：H7疫苗，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察重組載體疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)性，為發(fā)展新型的O157疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了579bp的EspA基因、1476bp的EspA-IntiminC300和1767bp的EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后分別連接到平衡-致死載體pYA3149上，再依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct的asd基因缺失突變株x6097、沙

6、門(mén)氏菌中間宿主x3730及終宿主菌x4550。IPTG誘導(dǎo)重組工程菌x4550(pYA3 149-EspA)、X4550(pYA3 149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149-EspA-Intimin C300-Stx2B)，成功表達(dá)了上述三種抗原蛋白，免疫印跡證實(shí)所表達(dá)蛋白能與相應(yīng)抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。 2．對(duì)重組減毒傷寒沙門(mén)氏菌載體疫苗株進(jìn)行體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，x4550(pYA3149-EspA)、

7、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)在有選擇壓力(不含DAP)和無(wú)選擇壓力(含DAP)的條件下傳10代后隨機(jī)挑取100個(gè)菌落分別接種于不含DAP的LB平板及含DAP的LB平板上培養(yǎng)，結(jié)果無(wú)論有無(wú)選擇壓力存在，所挑取的菌落99％均生長(zhǎng)，從中隨機(jī)選出20個(gè)菌落抽提質(zhì)粒，95％的菌落含有重組質(zhì)粒。表明構(gòu)建的重組工程菌在體外有較好的遺傳穩(wěn)定性。

8、 3．以重組減毒傷寒沙門(mén)氏菌載體疫苗口服免疫三次Balb/c小鼠后，各實(shí)驗(yàn)組免疫后血清特異性抗體GMT值與免疫前相比均差異顯著(p<0.001)，與對(duì)照組相比也差異顯著(p<0.001)。三次口服后再注射重組蛋白加強(qiáng)免疫一次，血清特異性抗體大幅增高(p<0.001)。 4．利用肥達(dá)氏反應(yīng)、SS選擇培養(yǎng)、PCR、免疫熒光等方法檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)重組減毒傷寒沙門(mén)氏菌載體疫苗3次口服免疫后能在小鼠脾、Peyer'S結(jié)和回腸定植，

9、且能特異表達(dá)O157的相關(guān)抗原。 5．免疫后小鼠以1×10<'9>CFU/只劑量的O157全菌液進(jìn)行攻毒免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明3次口服重組載體疫苗后x4550(pYA3149-EspA)、x4550(pYA3149-EspA-Intiminc300)及x4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)組保護(hù)率分別為36％、44％和62％，注射重組蛋白加強(qiáng)免疫后保護(hù)率分別提高到56％、67％和89％。不經(jīng)口

10、服只注射蛋白抗原的小鼠，免疫后保護(hù)率為0％、11％、11％。 結(jié)論： 1．采用平衡一致死系統(tǒng)分別構(gòu)建了表達(dá)O157：H7 EspA、EspA-IntiminC300及EspA-IntiminC300-Stx2B的重組減毒沙門(mén)氏菌載體疫苗株，并且構(gòu)建的疫苗株無(wú)論有無(wú)選擇壓力均能穩(wěn)定地在體外傳代培養(yǎng)。 2．構(gòu)建的針對(duì)O157的重組減毒傷寒沙門(mén)氏菌載體疫苗表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。三次口服免疫Balb/c小鼠，