不同類(lèi)型內(nèi)分泌干擾物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞影響的聯(lián)合作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.研究己烯雌酚（DES）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、丙基硫脲嘧啶（PTU）三種類(lèi)型內(nèi)分泌干擾物對(duì)GT1-7神經(jīng)細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)關(guān)系；
　　2.研究DES、DBP、PTU對(duì)GT1-7神經(jīng)細(xì)胞分泌GnRH的影響及其聯(lián)合作用；
　　3.研究DES、DBP、PTU聯(lián)合暴露對(duì)GT1-7神經(jīng)細(xì)胞分泌GnRH的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用永生化的下丘腦GT1-7神經(jīng)細(xì)胞模型，將三種受試物暴露24

2、h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。選擇的受試物及其濃度為：DES為0.1、1、10、100、1000μmol/L， DBP為0.01、1、10、100、1000μmol/L，PTU為0.0001、0.01、1、100、1000μmol/L，聯(lián)合作用的濃度設(shè)計(jì)為 DES0.1-1000μmol/L， DBP0.01μmol/L， PTU0.0001μmol/L。
　　2. CCK-8法檢測(cè)三種物質(zhì)單獨(dú)暴露和聯(lián)合暴露的GT1-7細(xì)胞存活率。
　

3、　3. GnRH放免試劑盒檢測(cè)單獨(dú)暴露組及聯(lián)合暴露組細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH的分泌量。
　　4. Western Blot檢測(cè)聯(lián)合暴露組PLC、GPR54、PKC、GnRH蛋白表達(dá)量。
　　5. RT-PCR檢測(cè)暴露組PLC、GPR54、PKC、GnRH基因表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1. GT1-7細(xì)胞單獨(dú)暴露于DES時(shí)，各染毒組細(xì)胞存活率由110％降至4%左右，暴露于DBP時(shí)各組細(xì)胞存活率由130%降至60%左右，

4、均表現(xiàn)為隨濃度的增大細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。細(xì)胞單獨(dú)暴露于PTU時(shí)，各組的細(xì)胞存活率相比對(duì)照組有所增加，但基本維持在一定水平120%-135%左右。DES、DBP、PTU單獨(dú)作用時(shí)，其濃度分別低于10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L時(shí)GT1-7細(xì)胞存活率在90%以上。而GT1-7細(xì)胞單獨(dú)暴露于此三種物質(zhì)時(shí)對(duì)GnRH的分泌量的影響則表現(xiàn)為隨DES濃度的增大呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，對(duì)照組2.36μg/ml，染毒

5、組由6.26μg/ml降至2.19μg/ml；隨DBP濃度的增大呈降低趨勢(shì)，由對(duì)照組2.60μg/ml降至染毒組1.66μg/ml、1.95μg/ml；隨PTU濃度的增大呈先增后降趨勢(shì)，對(duì)照組2.3μg/ml，染毒組由3.01μg/ml降至1.46μg/ml。
　　2. DES與PTU、DBP與PTU聯(lián)合暴露時(shí)，細(xì)胞存活率隨濃度增加表現(xiàn)為先增加后降低。相比DES單獨(dú)作用體系，0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L

6、PTU同時(shí)加入到0-10μmol/L DES后細(xì)胞存活率顯著增加，約為126%-160%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L PTU加入DES中后，GnRH的分泌量隨DES濃度的增加呈降低趨勢(shì)，表現(xiàn)為對(duì)照組4.23μg/ml，染毒組0.75μg/ml和1.50μg/ml。
　　3.聯(lián)合暴露時(shí)，Kisspeptins/GPR54信號(hào)通路上的各濃度組PKC蛋白表達(dá)量為1.8和1.3，各濃度組PLC蛋

7、白表達(dá)量為1.11和1.14，及DES為0.1μmol/L的GPR54組蛋白表達(dá)量為1.1，上述這些蛋白表達(dá)量相比對(duì)照組都有所增加；而各濃度組GnRH蛋白表達(dá)量為0.9和0.8，及DES為1μmol/L的GPR54組蛋白表達(dá)量為0.7，上述蛋白表達(dá)量相比對(duì)照組減少。而各濃度PKC基因表達(dá)量為3.9和2.8，GPR54基因表達(dá)量為2.2和1.0，PLC基因表達(dá)量為2.1和1.7，上述基因表達(dá)量相比對(duì)照組都有所增加，GnRH基因表達(dá)量0.8

8、和0.6，相比對(duì)照組減少。GPR54、PKC、PLC蛋白和基因表達(dá)量基本呈增大趨勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)GnRH蛋白及其基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與培養(yǎng)液內(nèi)GnRH分泌量的變化趨勢(shì)基本一致，呈降低趨勢(shì)，這與信號(hào)通路上幾種主要蛋白表達(dá)量的變化呈相反趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1. DES、DBP、PTU在一定濃度下共同暴露對(duì)GT1-7細(xì)胞增殖呈現(xiàn)聯(lián)合作用，根據(jù) DES濃度的不同表現(xiàn)為協(xié)同和拮抗效應(yīng)。當(dāng)0.01μmol/LDBP、0.0001μmol/

9、L PTU和0-10μmol/L DES聯(lián)合暴露對(duì)GT1-7細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為協(xié)同作用，0.01μmol/L DBP、0.0001μmol/L PTU和100μmol/L DES聯(lián)合暴露則對(duì)GT1-7細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為協(xié)同或相加效應(yīng)。
　　2. DES、DBP、PTU在一定濃度下共同暴露對(duì)GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)液中的GnRH分泌呈現(xiàn)聯(lián)合作用，表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。
　　3. DES、DBP、PTU聯(lián)合暴露時(shí)可能促進(jìn)Kisspeptins/