白芍總苷改善老年性癡呆的機(jī)制研究.pdf

1、目的：白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)為白芍根中提取的有效部位，主要含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芍總苷具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，保肝，抗氧化，并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)東莨菪堿致小鼠記憶形成障礙、亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙和乙醇致記憶再現(xiàn)障礙有明顯的改善作用。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)TGP對(duì)擬血管性癡呆大鼠的行為學(xué)

2、有一定的改善作用。為探索TGP改善老年性癡呆的作用機(jī)制，擴(kuò)大TGP的臨床應(yīng)用及研制治療老年性癡呆新藥，本研究采用體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH細(xì)胞，以連二亞硫酸鈉復(fù)制SK-N-SH細(xì)胞缺氧損傷模型，從細(xì)胞及分子水平，初步探討TGP防治老年性癡呆的作用機(jī)制。
　　方法：采用連二亞硫酸鈉建立SK-N-SH細(xì)胞缺氧損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(control組)、模型組(Na2S2O4缺氧無(wú)保護(hù)組)及TGP50，100，200

3、，400，800 mg/L。Na2S2O4于不同濃度TGP干預(yù)1h后加入，作用16h，觀察不同濃度的TGP對(duì)SK-N-SH細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用。⑴形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察各組SK-N-SH細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的變化。⑵MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：MTT法測(cè)定各孔的存活率，以O(shè)D值表示。⑶乳酸脫氫酶(LDH)活性及LDH釋放抑制率：上述損傷發(fā)生后16h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定LDH的活性。LDH釋放抑制率=(模型組LDH-

4、給藥組LDH)/(模型組LDH-對(duì)照組LDH)×100％⑷超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)順序加入相應(yīng)試劑，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD的吸光值并計(jì)算其活性，其單位以U/mL表示。⑸丙二醛(MDA)含量檢測(cè)：采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)順序加入相應(yīng)試劑，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的吸光值并計(jì)算其含量，其單位以nmol/mL

5、表示。⑹TUNEL法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，做細(xì)胞爬片。缺氧保護(hù)16h后，PBS洗3次，80％乙醇固定，晾干，保存，TUNEL法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞細(xì)胞凋亡。⑺Western blot法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平：缺氧保護(hù)16h后，收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，Western-blot法測(cè)定Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：

6、正常對(duì)照組SK-N-SH細(xì)胞呈圓形，較少有突起，為貼壁細(xì)胞，折光性較強(qiáng)；模型組多數(shù)細(xì)胞腫脹，折光度減弱，最終細(xì)胞成團(tuán)、漂浮，并有許多細(xì)胞崩解物，TGP各濃度組均較模型組細(xì)胞數(shù)量較多，折光性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞裂解碎片減少，多數(shù)細(xì)胞重新貼壁伸展。②TGP最佳作用濃度與最佳作用時(shí)間的確定：與正常對(duì)照組相比，模型組OD值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，TGP8、40 mg/L OD值有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGP200、

7、1000 mg/L OD值明顯高于模型組(P<0.01)，提示TGP最佳作用濃度在40～1000 mg/L之間，最終確定TGP預(yù)孵育濃度為如下梯度：50、100、200、400、800 mg/L，Na2S2O4(終濃度為5 mmol/L)于不同濃度TGP干預(yù)1h后加入，最佳預(yù)孵育時(shí)間為16h。③MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：與正常對(duì)照組相比，模型組OD值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，TGP50 mg/L OD值有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、差異(P>0.05)，TGP100、200、400、800 mg/L OD值均顯著高于模型組(P<0.01)，且最佳作用濃度為400mg/L。④乳酸脫氫酶(LDH)活性及LDH釋放抑制率：與正常對(duì)照組相比，模型組LDH漏出量顯著增大(P<0.01)；與模型組相比，TGP50、100、200、400、800 mg/L LDH漏出量顯著降低(P<0.01)，且TGP50、100、200、400 mg/L LDH漏出量呈濃度依賴性減少，TGP

9、800mg/L較400 mg/L LDH漏出量有所增加，提示TGP最佳作用濃度為400mg/L。⑤超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)：與正常對(duì)照組相比，模型組SOD活性顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，TGP50 mg/L SOD活性有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，TGP100、200、400 mg/L SOD活性均有顯著提高(P<0.01)，TGP800 mg/L較400 mg/L SOD活性有所下降，提示TGP最佳作

10、用濃度為400 mg/L，與MTT法結(jié)果一致。⑥丙二醛(MDA)含量檢測(cè)：與正常對(duì)照組相比，模型組MDA的含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，TGP各濃度組MDA含量均顯著下降(P<0.01)，MDA含量以TGP400 mg/L最低，與MTT法結(jié)果趨勢(shì)一致。⑦TUNEL法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞凋亡：顯微鏡下，由于細(xì)胞DNA斷裂的數(shù)量不同，陽(yáng)性細(xì)胞呈強(qiáng)弱不同的黃色，細(xì)胞核呈明顯的棕黃色為典型陽(yáng)性染色，圖像分析結(jié)果顯示：對(duì)照組SK-

11、N-SH細(xì)胞陽(yáng)性染色細(xì)胞明顯低于模型組，即模型組顯著高于對(duì)照組，TGP各濃度組均較模型組有明顯減少。⑧不同濃度TGP對(duì)SK-N-SH細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響：正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，TGP50、100、200、400、800 mg/L均較模型組有顯著減少(P<0.01)，且TGP最佳作用濃度400mg/L優(yōu)于其它濃度組，與MTT結(jié)果趨勢(shì)一致。

12、　　結(jié)論：⑴白芍總苷能提高Na2S2O4所致SK-N-SH細(xì)胞缺氧損傷的細(xì)胞存活率，降低LDH漏出量及MDA水平，提高SOD活性，清除自由基，減輕Na2S2O4對(duì)SK-N-SH細(xì)胞造成的缺氧損傷，提示白芍總苷可能通過(guò)抗自由基損傷實(shí)現(xiàn)對(duì)SK-N-SH細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用。⑵白芍總苷能夠抑制Na2S2O4所致SK-N-SH細(xì)胞凋亡，降低Caspase-3蛋白表達(dá)水平，推斷白芍總苷通過(guò)下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡可能是其治療