RNAi沉默AEG-1基因?qū)θ四I癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)構(gòu)建AEG-1的shRNA干擾質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞株，探討下調(diào)AEG-1的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、癌細(xì)胞凋亡和對(duì)5-氟尿嘧啶敏感性的影響及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。這些結(jié)果表明沉默AEG-1基因可以抑制細(xì)胞的增殖和集落形成，延緩及阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，最終促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，并增加了化學(xué)藥物敏感性。因此，AEG-1在腎細(xì)胞癌的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用并可能成為對(duì)腎細(xì)胞癌進(jìn)行基因治療的潛在靶點(diǎn)。<

2、br>　　材料和方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人類(lèi)腎癌細(xì)胞株Caki-1從中科院上海細(xì)胞所獲取，培養(yǎng)瓶中加入McCOY's5A培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich，USA)和10％胎牛血清，在條件為37℃和5％ C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天細(xì)胞密度為80％左右，更換培養(yǎng)液并加入0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化傳代。
　　二、質(zhì)粒構(gòu)建
　　用pGCsi-H1作為載體(GeneChem，China)構(gòu)建pGC

3、si-H1-AEG-1的干擾質(zhì)粒。
　　三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選
　　腎癌Caki-1細(xì)胞鋪于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105/孔，過(guò)夜培養(yǎng)。
　　四、Real-time PCR
　　總RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取各組細(xì)胞總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明(Takara,中國(guó))反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后采用BIONEER公司ExicyclerTM96熒光定量?jī)x進(jìn)行定量分析。

4、>　　五、Western Blot
　　加入蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，China)及PMSF提取總蛋白，冰上放置40 min，4℃12000 rpm/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。用Image J software檢測(cè)條帶的灰度值，進(jìn)而確定各組蛋白的表達(dá)量。β-actin作為內(nèi)參。
　　六、免疫組化和免疫熒光
　　免疫組化:臨床病理標(biāo)本取下后

5、多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，免疫組化SP法進(jìn)行染色，倒置顯微鏡觀察。免疫熒光:腎癌Caki-1細(xì)胞鋪在載玻片上，進(jìn)行細(xì)胞制片用4％多聚甲醛固定，4℃孵育過(guò)夜。
　　七、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞增殖通過(guò)3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法進(jìn)行檢測(cè)。
　　八、克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞以300個(gè)/皿的密度接種培養(yǎng)，每隔3天換液，37℃下培養(yǎng)細(xì)胞10-14天可形成肉眼可見(jiàn)的克隆，PBS洗

6、滌細(xì)胞兩次后用甲醇固定細(xì)胞。去除甲醇，PBS清洗3次，用瑞姬氏復(fù)合染料染色10 min，清水沖洗3次后拍照。顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于等于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為克隆數(shù)。
　　九、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡
　　對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞周期，細(xì)胞用胰酶消化后用70％預(yù)冷的乙醇固定過(guò)夜。在細(xì)胞中加入碘化丙啶(PI)和RNase(50μg/ml)，37℃孵育30min。通過(guò)流式細(xì)胞儀(BDBiosciences，美國(guó))檢測(cè)不同時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞凋

7、亡用AnnexinV FITC/PI凋亡試劑盒(KeyGen Biotech，中國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞密度達(dá)到80％后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞。用500μl Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5μl FITC-標(biāo)記AnnexinV溶液和5μl PI溶液，室溫下避光孵育15 min。冰浴避光存放，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　十、Hoechst33258染色
　　Hoechst33258染色用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞核的變化和凋

8、亡小體的形成。細(xì)胞達(dá)到80％融合以后，用4％多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌細(xì)胞。用Hoechst33258染色液(Beyotime Institute of Biotechnology)室溫下孵育30 min。棄去染色液滴加抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察，400倍鏡下進(jìn)行圖像采集數(shù)據(jù)分析。
　　十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間的差異用單因素方差分析(one way ANO

9、VA)進(jìn)行分析，多因素分析使用Bonferroni因果分析，GraphpadPrism5.0用于計(jì)算數(shù)據(jù)和制作圖形表格。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、AEG-1在腎癌組織中表達(dá)升高。
　　免疫組化實(shí)驗(yàn)中AEG-1在腎癌組織蠟塊切片中明顯高表達(dá)，相反的，正常的癌旁腎臟上皮細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)或是沒(méi)有蛋白表達(dá)或是表達(dá)微弱。實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，AEG-1主要在細(xì)胞質(zhì)和核周顯色，AEG-1蛋白的表達(dá)與腫瘤T分期、腫

10、瘤病理分級(jí)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　二、形成沉默AEG-1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)Caki-1細(xì)胞株。
　　為了研究AEG-1在腎癌中的作用，我們構(gòu)建了質(zhì)粒攜帶AEG-1 shRNA和陰性對(duì)照shRNA。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎癌Caki-1細(xì)胞后，篩選并獲得經(jīng)過(guò)G418耐受的細(xì)胞系，并且通過(guò)Real-time PCR and Western blot分析檢測(cè)AEG-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示AEG-1 shRNA介導(dǎo)的AEG-1的mRNA

11、和蛋白表達(dá)分別減少了72％和74％(P＜0.01)。免疫熒光分析結(jié)果表明AEG-1最初表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)域，與對(duì)照組相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞AEG-1熒光密度明顯降低。上述結(jié)果表明質(zhì)粒攜帶AEG-1的干擾片段植入腎癌Caki-1細(xì)胞后在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有效的沉默了AEG-1的表達(dá)，可以作為后續(xù)研究的有力的工具。
　　三、沉默AEG-1基因抑制Caki-1細(xì)胞的增殖和克隆。
　　我們用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默AEG-

12、1基因?qū)δI癌Caki-1細(xì)胞增殖能力的影響。AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)后，增殖能力明顯減低，明顯低于與對(duì)照組(P＜0.01)，在接下來(lái)的96小時(shí)和120小時(shí)均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)果表明，沉默AEG-1基因抑制Caki-1細(xì)胞的增殖和克隆。
　　四、沉默AEG-1將Caki-1細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　為了進(jìn)一步的理解AEG-1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的深層機(jī)制，我們檢測(cè)沉默AEG-1對(duì)細(xì)胞周期的影響。與

13、對(duì)照組相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞阻滯于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P＜0.01)。同時(shí)，處于S期的細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.01)。此外，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染后sub-G1期的凋亡細(xì)胞的比例增加明顯(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果表明與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞周期蛋白D1和E的表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。因此，沉默AEG-1基因可以將細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G0/G1期，因此抑制了細(xì)胞增殖。
　　五、沉默

14、AEG-1可以促進(jìn)Caki-1細(xì)胞凋亡。
　　我們采用Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默AEG-1基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。從Hoechst染色的典型結(jié)果中可以看出，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞具有明顯的凋亡小體，在對(duì)照組中卻很少發(fā)現(xiàn)有凋亡小體存在。通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比例，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的凋亡細(xì)胞的比例(19.91±4.85％)明顯高于control shRNA轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照

15、組（5.29±1.47％）和沒(méi)有轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組（4.58±1.36％）(P＜0.01)。此外，Westemblot結(jié)果表明在Caki-1細(xì)胞中，AEG-1shRNA轉(zhuǎn)染后明顯減低Bcl-2蛋白的表達(dá)且增加了Bax、cleaved-PARP和caspase-3蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。因此，我們的結(jié)果顯示AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染后抑制細(xì)胞的增長(zhǎng)也能導(dǎo)致細(xì)胞的體外凋亡。
　　六、沉默AEG-1增加腎癌細(xì)胞對(duì)5-FU的化學(xué)敏感性。

16、
　　為了進(jìn)一步研究沉默AEG-1基因?qū)aki-1細(xì)胞化療藥物（5-氟尿嘧啶，5-FU）敏感性的影響，我們用依次遞增的5-FU濃度處理陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，細(xì)胞維持48小時(shí)，然后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)5-FU處理可以引起濃度依賴性的生長(zhǎng)抑制，與對(duì)照組相比，5-FU對(duì)AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的抑制率明顯增加(P＜0.01)。更重要的是，與單獨(dú)5-FU處理陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)

17、胞相比(IC50:43μg/ml in Caki-1 cells and40μg/mlin control AEG-1 cells)，AEG-1 shRNA結(jié)合5-FU處理Caki-1細(xì)胞可以促使IC50值明顯下降(22μg/ml)。然后，用22μg/ml的5-FU處理并且收集細(xì)胞用作細(xì)胞增殖和凋亡分析。與對(duì)照相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性增高，這與MTT試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果是一致的。
　　結(jié)論: