轉錄因子PAX3對膠質瘤干細胞生物學作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：轉錄因子PAX3在膠質瘤干細胞中的表達及生物學作用
　　目的：
　　轉錄因子PAX3作為配對盒轉錄子家族一員，其不僅在神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而且在神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。我們前期工作中發(fā)現(xiàn)PAX3在人腦神經(jīng)膠質瘤組織中呈高表達，且與神經(jīng)膠質瘤惡性程度密切相關。膠質瘤干細胞作為種子細胞是膠質瘤發(fā)生、發(fā)展、治療失敗和復發(fā)的根源。本部分旨在研究轉錄

2、因子PAX3在人腦膠質瘤干細胞中表達及對人腦膠質瘤干細胞凋亡、增殖、侵襲及分化等生物學行為的影響，進一步探討其在人腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　方法：
　　1、對人腦膠質瘤干細胞系GSC11進行細胞培養(yǎng)及干細胞鑒定。通過單克隆實驗驗證膠質瘤干細胞的克隆形成能力。
　　2、采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)與免疫印跡技術(Western Blot)檢測人腦膠質瘤干細胞系GSC11、人腦膠質瘤細胞系U87及人

3、腦神經(jīng)膠質細胞系1800中轉錄因子PAX3的表達。
　　3、通過轉染PAX3真核過表達質粒及小分子干擾RNA技術(siRNA)分別對GSC11細胞中轉錄因子PAX3進行過表達和干擾表達，采用RT-PCR和Western Blot檢測過表達和干擾效果。采用Western Blot檢測干擾PAX3表達后對膠質瘤干細胞標志物CD133及Nestin表達的影響。流式細胞儀檢測GSC11細胞凋亡率;CCK-8法檢測GSC11細胞增殖能力;微

4、孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell小室實驗）檢測GSC11細胞侵襲能力;建立膠質瘤干細胞誘導分化模型，采用細胞免疫熒光法檢測對GSC11細胞分化的影響。
　　結果：
　　1、細胞免疫熒光檢測顯示GSC11細胞中CD133和Nestin表達陽性，單克隆實驗證實細胞具有良好的克隆形成能力，懸浮生長的膠質瘤干細胞聚集成球。
　　2、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細胞與U87細胞中PAX

5、3的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于1800細胞。
　　3、轉染或者干擾后GSC11細胞中的PAX3的mRNA及蛋白表達水平較對照組明顯增高或者降低。
　　4、干擾PAX3表達后GSC11細胞中CD133及Nestin表達水平明顯下降。
　　5、過表達PAX3后明顯抑制GSC11細胞凋亡，細胞增殖能力明顯增強，且細胞侵襲能力顯著提高;而抑制PAX3表達則明顯促進GSC11細胞凋亡，細胞增殖能力明顯下降，且細胞侵襲能力顯

6、著降低。
　　6、細胞免疫熒光法發(fā)現(xiàn)過表達PAX3的GSC11細胞分化明顯減弱，GFAP陽性細胞率顯著降低;而抑制PAX3表達的GSC11細胞分化明顯增強，GFAP陽性細胞率顯著升高。膠質瘤干細胞分化過程中轉錄因子PAX3表達與GFAP陽性細胞數(shù)呈負相關。
　　結論：
　　轉錄因子PAX3在膠質瘤干細胞中呈高表達。轉錄因子PAX3表達與膠質瘤干細胞生物學行為密切相關。抑制PAX3的表達可促進膠質瘤干細胞凋亡與分化，抑制

7、膠質瘤干細胞增殖與侵襲能力。轉錄因子PAX3有望成為膠質瘤干細胞治療新的靶分子。
　　第二部分：轉錄因子PAX3對膠質瘤干細胞中膠質纖維酸性蛋白基因的轉錄調(diào)控機制
　　目的：膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質細胞中主要的中間纖維素蛋白，參與構成細胞骨架，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多能干細胞向星形細胞分化的過程中起著關鍵作用，GFAF基因表達功能狀態(tài)對于膠質瘤細胞的生物學

8、功能也有重要影響。本文第一部分研究發(fā)現(xiàn)在膠質瘤干細胞向星型膠質細胞分化過程中轉錄因子PAX3與GFAP陽性細胞率呈負相關。本部分旨在進一步研究轉錄因子PAX3對膠質瘤干細胞中GFAP基因的轉錄調(diào)控機制。
　　方法：
　　1、采用RT-PCR與Western Blot檢測人腦膠質瘤干細胞系GSC11、人腦膠質瘤細胞系U87及人腦神經(jīng)膠質細胞系1800中GFAP的表達。
　　2、RT-PCR與Western Blot檢測轉

9、染過表達PAX3及siRNA干擾降低PAX3表達后GSC11細胞中GFAP表達，并分析PAX3與GFAP表達相關性。
　　3、通過染色質免疫共沉淀法(CHIP Assay)檢測轉錄因子PAX3在GSC11細胞中與GFAP基因啟動子相應區(qū)域結合情況。
　　4、予以構建正常及突變的人GFAP啟動子報告基因質粒，通過熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Luciferase Assay)檢測轉錄因子PAX3對GFAP基因啟動子相應結合位點的轉錄調(diào)

10、控活性。
　　5、依據(jù)測得的GFAP基因啟動子PAX3轉錄結合位點來設計探針序列，采用電泳遷移率試驗(EMSA)進一步驗證轉錄因子PAX3與GFAP基因啟動子相應位點結合情況。
　　結果：
　　1、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細胞與U87細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯低于1800細胞。
　　2、轉染過表達PAX3后GSC11細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯下降，而si

11、RNA干擾降低PAX3表達后GSC11細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯增加。膠質瘤干細胞中轉錄因子PAX3表達與GFAP表達呈負相關。
　　3、ChIP實驗結果證實轉錄因子PAX3在GSC11細胞中能與GFAP基因啟動子相應區(qū)域結合。
　　4、在成功構建正常與突變的GFAP啟動子報告基因質粒后，通過Luciferase Assay檢測發(fā)現(xiàn)過表達PAX3后正常GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性較對照組明顯提高。P1位

12、點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性明顯下降，而P2位點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性無明顯下降。轉錄因子PAX3對GFAP基因啟動子具有轉錄調(diào)控作用，且P1為其轉錄調(diào)控位點。
　　5、EMSA實驗進一步證實了轉錄因子PAX3能與GFAP基因啟動子結合位點P1特異性結合。
　　結論：
　　膠質瘤干細胞中轉錄因子PAX3表達與GFAP表達呈負相關。轉錄因子PAX3通過與膠質瘤干細胞中的GFAP基因啟動子區(qū)