擠壓式生物3D打印機初建與仿生細胞分布組織工程軟骨體外初步驗證.pdf

1、研究背景:細胞是生命結構和功能的基本單位，生物打印技術將細胞作為生物墨水打印構建組織和器官，標志著3D打印技術與生命科學的真正融合。與通常3D打印技術強調產品的制造精度和機械強度不同，生物打印技術更多的考慮的是細胞生物學表現(xiàn)。生物打印平臺的構建、打印方案的設計和打印后產品的評價都圍繞著細胞展開。由于生命科學極端復雜、多變，人類對細胞的理解十分粗淺，有太多的未知等待著探索，即使在科技發(fā)展日新月異的今天，生物打印技術仍然處在萌芽階段，現(xiàn)階段

2、生物打印技術的研發(fā)與應用仍然屬于概念驗證，距離實現(xiàn)具備生理功能的組織、器官的人工打印再造的目標仍有很長的路要走。
　　生物打印平臺的建立是實現(xiàn)生物制造的必要條件，亦是生物打印領域內面臨諸多挑戰(zhàn)之一。生物打印機絕不是簡簡單單堆砌細胞和生物材料的裝置，打印平臺的建立代表了細胞生物學、生物材料學、自動控制、信息學等諸多學科高水平交叉綜合應用的實力，體現(xiàn)了對生物打印核心技術的掌握。目前生物打印平臺的搭建技術并不成熟，根據打印的細胞、生物材

3、料以及打印的目的不同，生物打印平臺構建形式也多種多樣。世界上僅有少數(shù)幾個發(fā)達國家有能力開發(fā)商品化細胞生物打印機，雖然這種生物打印機具有產品集成化程度高，操作簡便等優(yōu)點，但由于打印材料有限，打印平臺軟硬件受專利保護，無法根據打印實際需要進行參數(shù)修改和軟硬件升級、優(yōu)化，商品化細胞生物打印機并未得到廣泛應用。
　　關節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質構成，沒有血管、神經和淋巴，幾乎沒有自我修復能力。一旦發(fā)生軟骨損傷往往導致關節(jié)功能不可逆損害，

4、最終引起骨關節(jié)炎發(fā)生，嚴重影響生活質量。軟骨損傷修復尚無理想的治療手段，軟骨組織工程聯(lián)合應用生命科學和工程制造的方法人工合成軟骨組織，是當前最有希望解決軟骨缺損修復困境的方法。分層構建組織工程軟骨是軟骨組織工程領域內的研究熱點，強調從結構和功能上模擬天然軟骨分層變化的規(guī)律。在哺乳動物關節(jié)軟骨組織中，都存在著軟骨細胞密度由軟骨淺層至深層成梯度下降的分布規(guī)律，這是關節(jié)軟骨發(fā)育和力學環(huán)境共同作用的結果，是關節(jié)軟骨重要的分層結構特點之一。復習文

5、獻，國內外尚無研究關注構建具備仿生軟骨細胞密度梯度分布規(guī)律的組織工程軟骨。
　　本研究期望自主建立擠壓式水凝膠細胞生物打印機驗證平臺，初步掌握3D生物打印核心技術，嘗試通過生物打印技術構建具備仿生軟骨細胞密度梯度分布的組織工程軟骨，驗證生物打印技術在軟骨組織工程中的應用，觀察軟骨細胞密度梯度分布生物學作用，探索一種分層構建組織工程軟骨的新策略。
　　方法:本研究利用開源軟硬件資料嘗試自主搭建擠壓式水凝膠生物打印驗證平臺，硬件

6、系統(tǒng)包括：Prusa i3三維打印機移動系統(tǒng)，數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng)；軟件應用包括：三維電腦輔助設計軟件（CAD軟件）Solidworks、切片軟件 Slic3r、打印機上位控制軟件Repetier-Host；選用3ml螺旋接口注射器作為水凝膠容器（生物打印墨水墨盒），25＃平頭針頭作為擠壓成型噴頭，10％豬膝關節(jié)軟骨II型膠原蛋白鹽酸（0.15M）水溶膠作為打印墨水；安裝Prusa i3三維打印機移動系統(tǒng)和數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng)構成擠壓式

7、水凝膠生物打印驗證平臺，使用Solidworks軟件設計三維實體模型，在切片軟件Slic3r中設置打印層厚、打印條帶走形方向及打印速度等參數(shù)，分割三維實體模型生成連續(xù)的二維輪廓，生物打印機在生成的Gcode代碼文件控制下完成水凝膠打印，打印成型的II型膠原溶膠塊置于37℃孵箱內30分鐘完成交聯(lián)；
　　本研究通過生物打印技術構建具備仿生軟骨細胞密度梯度分布的組織工程軟骨，實驗參考正常成人膝關節(jié)股骨髁軟骨中軟骨細胞總體密度約為1×10

8、7cell/mL，關節(jié)軟骨淺、中、深三層細胞密度之比約3：2：1，使用復合不同軟骨細胞密度的10%II型膠原蛋白水溶膠作為生物墨水，設計A組（細胞總體密度約為2×107cell/ml）、 B組（細胞總體密度約為1×107cell/mL）、 C組（細胞總體密度約為0.5×107cell/mL）三組組織工程軟骨，每組分別構建具有仿生軟骨細胞密度梯度分布和細胞均勻分布的兩類細胞分布形式組織工程軟骨，體外培養(yǎng)，分別于第0、1、2、3周取材，進行

9、細胞學、生化、組織學等相關檢測，對比分析仿生軟骨細胞密度梯度分布和細胞均勻分布的兩類組織工程軟骨，驗證生物打印技術，觀察仿生細胞密度梯度分布的生物學意義。
　　結果：擠壓式水凝膠生物3D打印驗證平臺得到初步建立，擠壓頭與三維運動系統(tǒng)匹配，系統(tǒng)運行平穩(wěn)，打印過程全程可控，通過優(yōu)化打印參數(shù)，3D細胞生物打印過程對細胞活性無明顯影響；擠壓式水凝膠生物3D打印平臺能夠實現(xiàn)仿生軟骨細胞密度梯度分布組織工程軟骨模型的構建，組織工程軟骨體外培養(yǎng)

10、3周，RT-qPCR結果顯示：組織工程軟骨中軟骨細胞基因COL1A1持續(xù)低水平表達且出現(xiàn)下調趨勢，基因COL2A1和ACAN表達水平隨培養(yǎng)時間延長呈上調趨勢，且具有統(tǒng)計學差異；核酸定量法測定組織工程軟骨細胞總量結果顯示：各時間點A、B、C三組中兩類組織工程軟骨（細胞均勻分布組織塊與細胞梯度分布組織塊）細胞總量無統(tǒng)計差異，隨培養(yǎng)時間延長各組組織工程軟骨細胞總量均出現(xiàn)無統(tǒng)計學意義的下降趨勢；組織工程軟骨樣本GAG定量結果顯示：體外培養(yǎng)第1周

11、，A、B、C三組GAG總量與支架中細胞總體密度呈正相關，A組GAG含量最高，C組最低；培養(yǎng)第2、3周，C組GAG總量仍然最低，A組和B組GAG含量無統(tǒng)計學差異，為評估單個細胞GAG合成活性，分別將各組GAG總量與細胞總數(shù)標準化處理，體外培養(yǎng)第1周，各組間單細胞GAG合成量無統(tǒng)計學差異，在第2、3周，A組單細胞GAG合成量最低， B組具有最高的單細胞GAG合成量，B組中兩類細胞分布組織塊單細胞GAG合成量無統(tǒng)計差異，但B組細胞密度梯度分布

12、組織塊單細胞GAG合成量與A、C兩組有統(tǒng)計差異，培養(yǎng)第3周，B、C兩組中細胞均勻分布組織塊單細胞GAG合成量有統(tǒng)計差異；免疫組化染色及阿爾新蘭染色結果顯示：免疫組化陽性染色細胞呈棕黃色，免疫組化陰性染色細胞呈藍色，GAG成分被阿爾新蘭染成藍色，組織工程軟骨中絕大多數(shù)軟骨細胞表現(xiàn)為 II型膠原蛋白陽性染色，一部分軟骨細胞表現(xiàn)為PRG4陽性，只有少數(shù)軟骨細胞出現(xiàn)I型膠原陽性染色，細胞密度梯度組軟骨細胞新和成的II型膠原蛋白、PRG4和GAG

13、成分呈現(xiàn)梯度分布規(guī)律，由淺層至深層逐漸減少。
　　結論：在熟悉并掌握生物3D打印相關基本原理和各系統(tǒng)軟硬件組成基礎之上，綜合應用機械自動控制技術和生命科學理論，能夠根據具體生物墨水和實際打印需要，利用開源軟硬件資料自主設計并建立擠壓式水凝膠生物打印驗證平臺，通過仿生細胞分布組織工程軟骨模型的建立，驗證了擠壓式水凝膠生物打印驗證平臺能夠實現(xiàn)軟骨細胞在水凝膠支架中精確的空間定位，通過優(yōu)化支架中細胞種植密度和分布模式能夠提高細胞活性，研