多肽與寡核苷酸偶聯(lián)純化方法及功能化寡核苷酸的應(yīng)用研究.pdf

1、寡核苷酸是一類短鏈核苷酸，其具有很強(qiáng)的生物活性。通過(guò)指數(shù)富集的配基進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選出能與蛋白、小分子、離子、細(xì)胞等受體特異性結(jié)合的寡核苷酸具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，能用于各種生物傳感。同時(shí)，寡核苷酸可作為基因治療藥物或藥物前體。但寡核苷酸具有細(xì)胞通透性差、易被分解且與目標(biāo)物親和力不強(qiáng)的缺點(diǎn)。而多肽具有分子量小，帶電量可調(diào)，抗酶水解等特點(diǎn)，將兩者進(jìn)行偶聯(lián)既可以提高細(xì)胞的通透性還可以提高寡核苷酸的生物活性。近年來(lái)各種多肽篩選技

2、術(shù)尤其是噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展，使得一大批具有識(shí)別、檢測(cè)和治療癌細(xì)胞功能的多肽不斷出現(xiàn)。這些多肽的發(fā)現(xiàn)給各種癌癥的診斷、治療帶來(lái)了新的思路和方法。將多肽與寡核苷酸進(jìn)行有效地連接，可得到具有雙功能的生物分子，或具有協(xié)同治療作用能實(shí)現(xiàn)診療一體化的藥物。故多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物(POCs)，在生物傳感和癌癥治療方面都具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。基于以上原因，本文開(kāi)展了以下的工作:
　　1、利用了Click反應(yīng)，EDC-NHS交聯(lián)羧基與巰基的直

3、接偶聯(lián)法和偶聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-SMCC)偶聯(lián)的方法合成了不同性質(zhì)的多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物，在合成過(guò)程中對(duì)合成各條件進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，來(lái)提高反應(yīng)效率。從理論和實(shí)踐中探討對(duì)合成效率有關(guān)鍵性影響的因素。討論了不同偶聯(lián)方法在合成多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物中的優(yōu)缺點(diǎn)，并指出各種方法適用范圍及最適的反應(yīng)條件。
　　2、為了尋求一種快速

4、、高效、規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化分離提純多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物的方法，我們利用高效液相色譜(HPLC)、離子交換色譜(IEC)、聚丙烯酰胺凝膠切膠回收、透析、超濾、核酸酶酶切等方法將合成好的混合物進(jìn)行提純，針對(duì)各種提純方法的特點(diǎn)進(jìn)行討論并將其用于改進(jìn)純化過(guò)程。對(duì)純化過(guò)程中遇到的各種問(wèn)題進(jìn)行分析和討論，總結(jié)給出了各種分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)。最后，結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理和結(jié)果對(duì)各種方法的適用條件和范圍給出了合理的建議。該結(jié)果對(duì)以后純化不同POCs給出了明確的指導(dǎo)和建議

5、。
　　3、利用一條帶有BHQ1熒光淬滅基團(tuán)的DNA與對(duì)Pb2+具有特異性的DNA酶鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)無(wú)Pb2+存在時(shí)向溶液中加入超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)。由于正負(fù)電荷的吸引作用scGFP與DNA雙鏈靠近，綠色熒光蛋白的熒光被BHQ1淬滅。當(dāng)存在Pb2+時(shí)，Pb2+能特異性識(shí)別DNA雙鏈中含有RNA的位點(diǎn)并將其切割，切割后的含有BHQ1的短鏈DNA從雙鏈上脫離并游離到溶液，此時(shí)再加入scGFP，游離到溶液中的BHQ1無(wú)法淬