虹鱒魚γ-INF誘導的溶酶體巰基還原酶及LIGHT(TNFSF14)的克隆、表達及生物學活性研究.pdf

1、干擾素-γ誘導的溶酶體巰基還原酶(GILT)在MHCⅡ抗原呈遞過程中起著還原二硫鍵的關鍵作用。LIGHT是TNF家族第14號成員，它在誘導腫瘤細胞凋亡、T細胞的共刺激、淋巴樣結構的發(fā)生與發(fā)育、樹突狀細胞的活化等過程中發(fā)揮著重要的作用。本文運用PCR、Real-time PCR、大腸桿菌原核表達、Westernbloting等分子生物學技術以及一些生物信息學方法，對虹鱒魚的GILT（rGILT）和LIGHT(rLIGHT)的核苷酸序列、氨

2、基酸序列、組織分布及重組蛋白部分生物學活性等方面進行了分析和研究。結果如下:
　　1虹鱒魚GILT的克隆、表達以及活性研究
　　從虹鱒魚脾臟中提取RNA繼而擴增得到虹鱒魚GILT基因(簡稱rGILT)。rGILT的cDNA序列長為762 bp，編碼253個氨基酸，蛋白分子量約為28.23 kDa，其理論等電點約為4.94。虹鱒魚GILT蛋白包含GILT蛋白的特征性結構序列:CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C。且進化分

3、析表明rGILT與其他物種的GILT起源于同一祖先。實時定量PCR結果表明，rGILT的表達具有組織特異性，并且經過LPS刺激后，其在脾臟細胞和腎細胞中的表達量明顯上調，而虹鱒魚干擾素-γ（簡稱rIFN-γ）在這些細胞中的mRNA表達水平也有類似趨勢。隨后在BL21(DE3)中表達了帶有His標簽的pET28a-rGILT重組蛋白，并進行了SDS-PAGE和Western Blot鑒定。最后，將人IgG抗體作為底物，我們測定了rGILT

4、的巰基還原酶活性。這些結果表明，rGILT能夠還原二硫鍵，對機體的天然免疫防護有重要作用，同時也為魚類免疫中GILT的角色提供新的研究依據(jù)。
　　2虹鱒魚LIGHT的克隆、可溶區(qū)表達和組織定量分析
　　本文選擇虹鱒魚作為研究對象，通過RT-PCR的方法從虹鱒魚的脾臟組織中擴增得到開放閱讀框為717 bp的LIGHT基因，并對這個基因在不同物種中的同源關系進行了進化分析。通過Real-time PCR的方法對LIGHT基因在不