乳酸桿菌表面活性片段通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控腸上皮炎性細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察MIMP對炎癥性腸病小鼠的腸道炎癥及腸道微生態(tài)的影響；探究MIMP對炎性細(xì)胞因子的作用效果和調(diào)節(jié)方式，并探討相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）將小鼠分為3組：DSS+MIMP組，DSS組和健康對照組。干預(yù)期間，觀察小鼠體重變化情況，腹瀉、血便、死亡等發(fā)生率，觀察各組小鼠腸道整體情況并制作H&E染色切片，觀察腸上皮組織病理學(xué)的改變；利用右旋糖苷異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocy

2、anate-dextran,FITC-Dextran）灌胃，檢測小鼠活體腸道通透性，并利用蛋白質(zhì)印跡（Western blot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測各組小鼠腸道上皮中緊密連接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表達(dá)水平；利用qRT-PCR檢測各組小鼠腸道上皮中炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的表達(dá),利用1

3、6SrRNA測序技術(shù)檢測各組小鼠腸道微生態(tài)的變化情況。
　?。?）利用類小腸上皮細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞（PBMCs）在Tranwells條件下建立共培養(yǎng)模型，利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為炎癥刺激，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對腸道微環(huán)境中炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的調(diào)節(jié)情況。利用ELISA和q

4、RT-PCR檢測TLR4抑制劑對LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌水平的影響，并與MIMP的作用效果相互比較。利用Western blot檢測MIMP和TLR4抑制劑對MAPK及NF-κB通路的調(diào)節(jié)情況，并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對NF-κB活性影響的變化趨勢。
　?。?）利用Western blot檢測MIMP及TLR4抑制劑對由LPS介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞整體水平的組蛋白（H3,H4）乙?；?/p>

5、調(diào)節(jié)情況，利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)技術(shù)檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對具體水平的IL-17及IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白（H3,H4）乙?；恼{(diào)節(jié)情況；利用qRT-PCR檢測MIMP對LPS介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化酶(histone deaceylase,HDAC)表達(dá)水平的調(diào)節(jié)情況。
　　結(jié)果：
　　（1）與DSS組小鼠相比，MIMP+DSS組整體情況較好，體重減輕程度輕，腹瀉、便血及死亡發(fā)生率低，疾病活

6、動指數(shù)顯著下降；MIMP不但可以改善腸道整體情況，提高腸道長度(p<0.05)，還可有效提升組織學(xué)評分(p<0.001)；MIMP+DSS組血漿中 FITC-Dextran的含量顯著低于 DSS組(p<0.01)，而腸上皮中緊密連接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表達(dá)水平則顯著高于 DSS組(p<0.01)。此外，MIMP可降低腸道上皮中促炎性細(xì)胞因子（IFN-γ,IL-17,IL-23）的水平，并升高抑炎性細(xì)胞因子（I

7、L-4,IL-10）的水平。16SrRNA測序發(fā)現(xiàn)MIMP+DSS組較DSS腸道微生態(tài)多樣性顯著提升，shannon指數(shù)顯著降低(p<0.05),simpson指數(shù)存在一定上升趨勢(p=0.055)；主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis, PCoA)提示三組小鼠腸道微生態(tài)在各分類學(xué)水平上存在明顯差異；樣本聚類樹與柱狀圖組合分析(The sample clustering tree and histogr

8、am analysis)提示MIMP+DSS組與健康對照組腸道微生態(tài)的相似程度更高；線性判別分析(LEfSe)分析顯示厚壁菌屬(Firmicute)是 DSS組小鼠腸道中的優(yōu)勢菌屬，明串珠菌屬(Leuconostocaceae)是DSS+MIMP組的優(yōu)勢菌屬，擬桿菌屬(Bacteroides)是健康對照組腸道中的優(yōu)勢菌屬。
　?。?）在共培養(yǎng)模型中，MIMP可扭轉(zhuǎn)因LPS引起的炎性細(xì)胞因子的分泌，降低促炎性細(xì)胞因子（IFN-γ,I

9、L-17,IL-23）的水平，升高抑炎性細(xì)胞因子（IL-4,IL-10）的水平；且 MIMP的調(diào)節(jié)存在一定的劑量與時間依賴性，在特定濃度和時間時(1ng/ml,12h)，MIMP的作用效應(yīng)最為顯著；同時抑制性實驗證實MIMP與TLR4抑制劑具有相同的調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的能力；此外，MIMP和TLR4抑制劑均可有效
　　阻斷MAPK及NF-κB通路激活，且隨著MIMP劑量的提高和時間的延長，NF-κB的活性也呈現(xiàn)階梯狀下降趨勢。

10、>　?。?）LPS可使得組蛋白（H3,H4）整體水平的乙酰化程度提高，而 MIMP與 TLR4抑制劑干預(yù)可有效降低其乙酰化程度，并存在劑量依賴性；在具體水平中，隨著劑量的提高和時間的延長，MIMP可有效降低IL-17和IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白（H3,H4）的乙?；潭?；同時，MIMP還可以顯著上調(diào)部分HDAC的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　MIMP可有效改善IBD小鼠的炎癥狀態(tài)及腸屏障功能，顯著下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)