酸棗仁黃酮的制備及其在N1E-115細(xì)胞中的抗氧化應(yīng)激作用研究.pdf

1、氧化應(yīng)激與人體多種疾病密切相關(guān)，其中包括阿爾茨海默綜合癥（Alzheimer Disease,AD），帕金森綜合癥（Parkinson’s Disease,PD）及亨廷氏舞蹈癥（Huntington’s Disease,HD）三大神經(jīng)退行性疾病。丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，可誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，常存在于油炸類食品中，而該類食品又是中國傳統(tǒng)美食不可或缺的一部分，因此，開發(fā)一種能夠有效抑制丙烯酰胺氧化損傷的天然抗氧化劑具有重要的意義。酸棗仁（

2、Semen Ziziphi Spinosae,SZS）作為中國傳統(tǒng)中藥，具有多種藥理作用，如鎮(zhèn)靜安眠和降壓等。最新研究表明，酸棗仁黃酮具有明顯的抗氧化活性，是一種潛在的天然抗氧化劑，具有良好的開發(fā)前景，但目前對(duì)酸棗仁黃酮的抗氧化活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制研究尚未見系統(tǒng)報(bào)道。因此，本課題采用乙醇加熱回流提取法結(jié)合多種色譜技術(shù)從酸棗仁中制備黃酮化合物，并利用HPLC-MS/MS對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用多種體外抗氧化活

3、性研究方法考察酸棗仁黃酮的抗氧化活性，并研究不同化合物結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關(guān)系。以N1E-115細(xì)胞為模型，通過考察細(xì)胞活力、活性氧、還原型谷胱甘肽含量、線粒體膜電位、丙二醛水平及相關(guān)蛋白表達(dá)水平等方面，深入研究酸棗仁黃酮對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的N1E-115細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，主要研究成果如下：
　　（1）采用乙醇加熱回流提取法，并結(jié)合多種色譜技術(shù)得到6種酸棗仁黃酮化合物。利用HPLC-MS/MS法確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，確定6種

4、化合物分別為斯皮諾素（S）、異牡荊素-2’’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（IVG）、6’’’-阿魏酰斯皮諾素（6-FS）、6’’’-對(duì)香豆酰斯皮諾素（6-CS）、異牡荊素（IV）及當(dāng)藥素（ST）。
　?。?）利用多種體外抗氧化活性研究方法研究酸棗仁黃酮化合物抗氧化活性，并分析討論其抗氧化活性與結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：總還原力IV>6-CS>IVG>6-FS>ST>S；ABTS自由基清除能力6-CS>IV>6-FS

5、>IVG>ST>S；DPPH自由基清除能力6-CS>6-FS>IV>IVG>ST>S；超氧陰離子自由基清除能力6-CS>IV>6-FS>IVG>ST>S；脂質(zhì)過氧化物清除能力6-CS>IV>6-FS>IVG>S>ST。結(jié)果顯示，6種酸棗仁黃酮都表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力。并且在不同指標(biāo)上表現(xiàn)出不同的強(qiáng)度，一般規(guī)律為：化合物的抗氧化能力與結(jié)構(gòu)中羥基化水平成正比，與糖基化水平成反比，且A環(huán)的鄰位取代-OH能使抗氧化性顯著增強(qiáng)，C-6'''位阿魏

6、?；c對(duì)香豆酰基能夠顯著提高抗氧化性。
　?。?）以N1E-115細(xì)胞為模型，利用分子熒光探針，化學(xué)發(fā)光法探究6-CS對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，丙烯酰胺可顯著誘導(dǎo)N1E-115細(xì)胞氧化損傷（5 mmol/L丙烯酰胺處理24 h，細(xì)胞活力值降為64.51％），而10μmol/L，20μmol/L和50μmol/L6-CS均可顯著抑制丙烯酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷（細(xì)胞活力值分別為73.21%，80.12%和89.

7、05%；此外，丙烯酰胺可顯著誘導(dǎo)N1E-115細(xì)胞發(fā)生活性氧累積、線粒體膜電位下降、還原型谷胱苷肽含量下降等，而10μmol/L，20μmol/L和50μmol/L的6-CS均可通過顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，恢復(fù)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽水平、線粒體膜電位水平，清除胞內(nèi)丙二醛達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。
　?。?）Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙烯酰胺能夠通過誘導(dǎo)N1E-115細(xì)胞的氧化應(yīng)激來促進(jìn)LC3II/I和p62的蛋白表達(dá)，并抑制T