小鼠胸腺及其對(duì)異種抗原細(xì)胞的應(yīng)答.pdf

1、研究背景與目的
　　胸腺是哺乳動(dòng)物的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，胸腺為T細(xì)胞發(fā)育提供了一個(gè)縝密而復(fù)雜的微環(huán)境，有序的調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育成熟和遷移。胸腺基質(zhì)細(xì)胞、可溶性分子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成T細(xì)胞發(fā)育的胸腺微環(huán)境。胸腺基質(zhì)細(xì)胞間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅起網(wǎng)狀支架作用，而且由于這些細(xì)胞表面攜帶大量表面分子、并可以分泌多種胸腺激素和細(xì)胞因子，從而為胸腺細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供合適的微環(huán)境。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)經(jīng)歷TCR重排，陽(yáng)性

2、選擇和陰性選擇等發(fā)育過(guò)程最終發(fā)育為成熟的T淋巴細(xì)胞并遷移到外周免疫器官。
　　根據(jù)傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性中樞耐受的理論機(jī)制，如果T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中在胸腺內(nèi)接觸到異基因的抗原，則會(huì)被誘導(dǎo)出對(duì)該異基因外周移植物的耐受，同時(shí)，血-胸腺屏障使血液中的大分子物質(zhì)包括外來(lái)抗原不能進(jìn)入胸腺，所以胸腺內(nèi)注射異基因抗原可以躲過(guò)免疫監(jiān)視，誘導(dǎo)出對(duì)異基因抗原耐受的T細(xì)胞。為了探索異種抗原細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)特性及機(jī)體產(chǎn)生的免疫耐受和免疫排斥情況，我們將作為異種不同

3、組織的、MHC差異較大的抗原人肝癌細(xì)胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中，動(dòng)態(tài)觀察小鼠胸腺對(duì)其發(fā)生的應(yīng)答，進(jìn)而了解抗原在小鼠胸腺微環(huán)境中對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響及胸腺內(nèi)可能發(fā)生的免疫應(yīng)答機(jī)制和外源人肝癌細(xì)胞對(duì)胸腺微環(huán)境及T細(xì)胞發(fā)育分化的影響，以及異種人肝癌細(xì)胞在小鼠胸腺內(nèi)的命運(yùn)。
　　研究方法
　　1.小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對(duì)小鼠胸腺造成的組織病理變化分析
　　1)小鼠胸腺發(fā)育情況分析;
　　2)

4、細(xì)胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記;
　　3)胸腺內(nèi)注射方法的簡(jiǎn)化;
　　4)注射效率的評(píng)估:解剖學(xué)觀察判斷及FCM分析檢測(cè)注射效率;
　　5)注射后小鼠體重變化分析與注射方法對(duì)小鼠的損傷評(píng)估;
　　6)石蠟切片制作與HE染色觀察:
　　2.小鼠胸腺對(duì)異種抗原細(xì)胞的應(yīng)答
　　1)人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記;
　　2)小鼠胸腺內(nèi)注射入肝癌細(xì)胞;
　　3)小鼠胸腺組織稱重及胸腺細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù);
　　4

5、)石蠟切片制作與HE染色觀察胸腺組織病理變化;
　　5)FCM分析胸腺內(nèi)各類細(xì)胞亞群比例的變化（T細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞及調(diào)節(jié)性細(xì)胞）;
　　6)FCM分析胸腺細(xì)胞凋亡情況;
　　研究結(jié)果
　　第一部分:小鼠胸腺發(fā)育情況分析
　　小鼠在青春期前快速生長(zhǎng)和發(fā)育，到青春期時(shí)達(dá)到一個(gè)頂峰，在此之后便開(kāi)始萎縮;小鼠胸腺的體積也隨年齡增長(zhǎng)而變化。
　　Dil染色標(biāo)記觀察
　　Hep-G2人肝癌細(xì)胞在含有2

6、0ug/mlDiI的基本培養(yǎng)基中標(biāo)記30min后，細(xì)胞標(biāo)記成功，并發(fā)射出強(qiáng)烈的紅色熒光。
　　注射效率評(píng)估
　　通過(guò)解剖學(xué)觀察，成鼠組的注射成功率為81.47％，乳鼠組的注射成功率為76％，F(xiàn)CM分析的結(jié)果證實(shí)此種注射方法基本能夠保證注射的準(zhǔn)確性。
　　注射方法對(duì)小鼠損傷程度的評(píng)估
　　通過(guò)對(duì)注射后小鼠行為及體重的變化分析，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠在體重和行為上均未表現(xiàn)出明顯變化，由此我們認(rèn)為此注射方法對(duì)小鼠的

7、損傷程度很小，值得應(yīng)用和推廣。
　　石蠟切片HE染色觀察結(jié)果
　　Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)遭遇到淋巴細(xì)胞的攻擊與殺傷，注射后3d就檢測(cè)到淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及巨噬細(xì)胞的募集;注射后7d，大部分的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)死亡，腫瘤細(xì)胞周圍密集大量的淋巴細(xì)胞;注射后14d，已經(jīng)檢測(cè)不到存活的腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞形態(tài)模糊，周圍大量淋巴細(xì)胞密集;注射后21d和28d，已經(jīng)檢測(cè)不到腫瘤細(xì)胞的存在。
　　第二部分:胸腺重量及胸腺細(xì)胞總數(shù)變化
　

8、　相比于平行對(duì)照組，胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后7d，14d及21d實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺重量明顯增加，而此時(shí)的胸腺細(xì)胞總數(shù)卻明顯減少。
　　小鼠胸腺組織有一定損傷
　　注射后3d檢測(cè)到注入人肝癌細(xì)胞的胸腺組織區(qū)域有機(jī)械損傷的跡象，有的能明顯看出是注射針在胸腺內(nèi)入針時(shí)造成的機(jī)械損傷，有些則為細(xì)胞懸液及注射針推力共同作用的結(jié)果。
　　小鼠胸腺組織皮質(zhì)與髓質(zhì)比例變化
　　胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后3d，檢測(cè)到胸腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞密集的區(qū)域

9、為大面積的髓質(zhì)區(qū)，而注射后14d的結(jié)果顯示髓質(zhì)區(qū)明顯增加，而皮質(zhì)區(qū)卻很少。胸腺上皮細(xì)胞變化
　　小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后，梭形上皮細(xì)胞聚集并環(huán)繞在腫瘤細(xì)胞周圍，注射后16d上皮細(xì)胞非常密集并環(huán)繞腫瘤細(xì)胞殘骸形成橢圓形結(jié)構(gòu)，注射后21d和28d數(shù)層鱗狀上皮細(xì)胞環(huán)繞圍成同心圓結(jié)構(gòu)包繞腫瘤細(xì)胞殘骸，注射后2個(gè)月胸腺組織恢復(fù)正常。胸腺內(nèi)注射后，在小鼠胸腺組織空隙的地方檢測(cè)到上皮細(xì)胞的富集，提示上皮細(xì)胞參與了胸腺組織的重建過(guò)程。
　

10、　FCM檢測(cè)胸腺內(nèi)各類細(xì)胞亞群變化
　　與對(duì)照組小鼠相比，注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少，CD4CD8雙陰性細(xì)胞、CD4/CD8單陽(yáng)性細(xì)胞及NKT細(xì)胞的比例有明顯升高現(xiàn)象;注射后2周檢測(cè)到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例也有增高的現(xiàn)象;注射后3周胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞的比例未見(jiàn)有明顯變化;
　　胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　胸腺內(nèi)注射Hep-G2后1周，實(shí)驗(yàn)組小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡率有明顯升高現(xiàn)

11、象，注射后3周凋亡率沒(méi)有明顯變化。
　　研究結(jié)論
　　1.通過(guò)對(duì)小鼠胸腺內(nèi)注射方法進(jìn)行簡(jiǎn)化，我們構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的小鼠胸腺內(nèi)注射的方法用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究。
　　2.明確了異種人肝癌細(xì)胞Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)被免疫細(xì)胞攻擊與清除的命運(yùn)，并初步確定巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及成熟的T淋巴細(xì)胞均參與了Hep-G2細(xì)胞的免疫攻擊與清除。
　　3.Hep-G2的注入，對(duì)小鼠胸腺組織造成一定的病理?yè)p傷，包括注射造成的胸腺組織機(jī)械損傷