植物細胞全能性

1、植物細胞全能性,徐曉洋2011201043,植物細胞全能性（totipotency）：指植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下，任何一個細胞都可以發(fā)育成一個新個體。植物細胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎。,1、植物細胞全能性的早期研究,2、植物細胞全能性理論的實驗證據,5、展望,4、植物細胞全能性（組織培養(yǎng)）的應用,,3、植物細胞全能性的調控機制,德國植物生理學家科戈特利布·

2、;哈布蘭特（Gotlieb Haberlandt，1854-1945）在1902年提出植物細胞全能性的理論 ，即植物體細胞在適當的條件下 ，具有不斷分裂和繁殖 、發(fā)育成完整植株的能力。,1、植物細胞全能性的早期研究,Gotlieb Haberlandt,Plant Tissue Culture: 100 years since Gottlieb Haberlandt,History of plant tissue culture,Mol

3、ecular Biotechnology Volume 37, Number 2, 169-180, DOI: 10.1007/s12033-007-0031-3,戈特利布·哈布蘭特將分離的小野芝麻柵欄細胞 、大花鳳眼蘭葉柄木質部髓細胞 、療肺草和蕁麻腺毛細胞 、紫鴨拓草雄蕊絨毛細胞等 ，培養(yǎng)在克諾普鹽溶液添加葡萄糖和蛋白胨的培養(yǎng)基中 ，以誘導培養(yǎng)細胞的分裂和分化。雖然 這些培養(yǎng)細胞能合成淀粉 ，體積增大 ，存活幾個星期 ，

4、但沒有細胞分裂發(fā)生。主要原 因是他所選擇的實驗材料和培養(yǎng)基不適合。在以后的研究中，培養(yǎng)基成分的研究成為組織培養(yǎng)研究或植物細胞全能性研究的一個突破口。,20世紀 30年代至50 年代期間，隨著B族維生素的應用 、生長素和細胞分裂素的發(fā)現(xiàn) ，為完善培養(yǎng)基成分和進行植 物組織培養(yǎng)奠定了基礎。,1957年斯科格和米勒 (Skoog and Miller) 提出植物激素控制器官形成的概念 ，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中根和芽的分化取決于生長素與細胞分

5、裂素的相對濃度 ，比例高時促進生根 ，比例低則促進芽的分化 。 1962年 ，穆拉希格和斯科格(Murashige and Skoog)提 出了適合于煙草組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基 ，并成為現(xiàn)今應用最廣的一種培養(yǎng)基 。這些研究為用實驗證實植物細胞的全能性 打下了堅實的基礎。,2、植物細胞全能性理論的實驗證據,要證實植物細胞的全能性 ，需要解決兩個問題 ，一是離體單細胞增殖 ，二是從單細胞增殖的組織發(fā)育成完整植株。,第一

6、個問題在發(fā)展細胞培養(yǎng)裝置后得到解決，先后發(fā)展了四種培養(yǎng)方式：震蕩培養(yǎng)，平板培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)和懸滴培養(yǎng)。,在細胞培養(yǎng)的基礎上賴納特和斯圖爾德(Reinert和Steward,1958)報道了胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細胞和愈傷組織形 成體細胞胚，首次用實驗科學地論證了植物細胞全能性。,胡蘿卜(Reinert and Steward,1958),煙草(Vasi 1965),花藥培養(yǎng)(Guha and Maheswari,1966),原生質體培養(yǎng)(Naga

7、ta and Takebe,1971),3、植物細胞全能性的調控機制,植物細胞全能性的證實推動了植物組織培養(yǎng)及其相關研究領域的迅猛發(fā)展。在莖尖和愈傷組織培養(yǎng)研究中，我 國已有 700種以上的植物能離體再生植株。盡管如此 ，植物細胞全能性的調控機制仍然不清楚 ，吸引人們從細胞學 、分子生物學等方面進行研究。,3.1 細胞學研究,植物體細胞全能性的表達 ，需要誘導分化成熟的細胞脫分化成為分生組織細胞 ，再誘導分生組織或愈傷組織分化不定芽或

8、體細胞胚胎 ，最后形成完整植株。,在研究胡蘿卜培養(yǎng)細胞的體細胞胚發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)有感受態(tài)細胞的存在。感受態(tài)細胞指外植體細胞在培養(yǎng)初期獲得能被誘導形態(tài)發(fā)生的狀態(tài)的細胞 。,胡蘿卜感受態(tài)細胞可以分成以下幾類：B狀態(tài)細胞 ，球形且液泡化 、直徑約為 12μm的細胞；C狀態(tài)細胞 ，球形且細胞質豐富 、直徑約為12μm的細胞； D狀態(tài)細胞 ，長形 、液泡化的細胞。,B狀態(tài)細胞的細胞壁存在阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP），而 C狀態(tài)細胞不含AGP。麥克

9、凱布（McCabe，1997）等 ，利用能夠識別上糖類抗原簇的單克隆抗體JIM8 ，進行細胞免疫熒光標記 ，揭示了胡蘿卜感受態(tài)細胞發(fā)生和生長發(fā)育的過程。,B狀態(tài)細胞細胞壁能被 JIM8抗體標記(深灰色)，B狀態(tài)細胞細胞壁出現(xiàn)極性時，只有一半細胞壁能被JIM8抗體標記 ，并開始進行細胞分裂 ，形成不能被JIM8標記的C狀態(tài)細胞和完全被 JIM8標記的F狀態(tài)細胞 。C狀態(tài)細胞是胚胎感受態(tài)細胞 ，與來自B狀態(tài)細胞的信號分子反應后形成胚胎決定細

10、胞，并繼續(xù)發(fā)育成體細胞胚 。F狀態(tài)細胞逐漸萎縮，成為 G狀態(tài)細胞 ，最后細胞死亡 。（ McCabe，1997）,3.2 分子生物學研究,分子生物學研究發(fā)現(xiàn) ，從成熟細胞脫分化開始 ，一些基因的表達就與形態(tài)發(fā)生或細胞全能性表達有關。,在與體細胞胚發(fā)生有關的許多蛋白質和基因克隆研究中 ，發(fā)現(xiàn)對植物細胞獲得胚性感受 態(tài)起作用的基因是體細胞胚胎發(fā)生的受體激酶基因（somatic embryogenesis receptor kinase ,

11、 SERK），該基因表達被認為是胚性細胞的標記 。,l997年，Schmidt 等在胡蘿下胚軸胚性細胞培養(yǎng)物中分離出的一段 cDNA克隆編碼一種 LRR—RLK，由于它首先在體胚發(fā)生過程的胚性單細胞中表達，因此命名為體細胞胚胎發(fā)生相關類受體蛋白激酶 (somatic embryogenesis receptor kinase , SERK) 基因。,SERK 基因家族：,DcSERK AtSERK1 - AtSERK5 ZmSE

12、RK1- ZmSERK3 OsSERK1 – OsSERK2 GhSERK1- GhSERK3 TcSERKMtSERK1 – MtSERK21,SERK 基因結構,DcSERK首先在培養(yǎng)了7 d的胚性培養(yǎng)物中表達。下胚軸培養(yǎng)5 d 時，增大的細胞開始出現(xiàn)，7 d時增生細胞團表面的一些起源于原維管組織的增大細胞開始表達 SERK。隨后的培養(yǎng)過程中，一些小型細胞簇也表達SERK，這些細胞都發(fā)育成體胚。原位雜交結果表

13、明，SERK表達在時間與數量上都與 “ 感受態(tài)細胞”的出現(xiàn)緊密相關。 RT-PCR后Southern雜交也表明，SERK 表達和外植體感受態(tài)細胞開始出現(xiàn)之間存在密切的相關， 認為 SERK是感受態(tài)細胞的一種標記 。,A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos,Deve

14、lopment 124, 2049-2062 (1997),Ed D. L. Schmidt, Flavia Guzzo, Marcel A. J. Toonen and Sacco C. de Vries,在擬南芥等其他植物中，SERK不僅在胚性細胞中表達，在某些非胚性細胞中也有表達。 AtSERK1 的表達比較廣泛， 不僅在早期的合子胚及培養(yǎng)的胚性細胞內大量表達， 還在雌配子體、孢子體原基周圍細胞層、表皮細胞

15、及成熟的根莖葉維管組織中少量表達，在合子胚發(fā)育中只表達到心形期。,TcSERK與ZmSERK2、MtSERK1 的表達方式相似， 在合子胚和體細胞胚的整個發(fā)育過程中均表達。TcSERK不僅在胚性愈傷和增生胚中大量表達，還在葉片中有微量表達, 但在根、花瓣及退化雄蕊中沒有表達信號。,SERK 基因的表達調控,不同植物的SERK基因有特定的表達方式，部分SERK基因在體細胞胚發(fā)生過程中是過渡性表達的， 暗示SERK基因的表達可能受到嚴格調

16、控。,Kim等對苜蓿進行高胚性和低胚性細胞培養(yǎng) ，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基內添加細胞分裂素類似物BAP(6-benzylaminopurine)和生長素類似物NAA(1-naphthaleneacetic acid)的培養(yǎng)物MtSERK1 的表達水平在 2 天內可顯著地提高，且這種誘導作用至少持續(xù)了 5 周。而培養(yǎng)基內不添加任何植物生長物質的培養(yǎng)物MtSERK1 的表達水平在 2天后迅速降低，表明植物生長物質BAP和NAA可能參與了MtSERK1 表

17、達的誘導或維持。,以上研究結果表明植物生長物質參與了SERK基因的表達調控，且在不同植物中可能存在不同的調控機制。,在SERK基因表達的負式調控機制中，擬南芥AtSERK1研究得最清楚。 AMP1蛋白很可能對AtSERK1的表達起負式調控作用，因為amp1 突變體比AtSERK1過量表達更能提高體細胞胚發(fā)生率； amp1 突變體的AtSERK1 表達水平遠遠高于野生型； 胚狀體萌芽后，AMP1 蛋白的逐步積累與AtSERK1 表達降低或

18、消失又相一致。,AMP1 蛋白是谷氨酸羧肽酶，有清除小分子和小信號肽分子的功能，而AtSERK1 蛋白的N端恰恰具有信號肽的特征， 這可能是AMP1 蛋白負式調控AtSERK1 表達的分子機理。,SERK 基因可能的其他功能：,· SERK 參與孢子體發(fā)育： 擬南芥serk1 或serk2 的單突變體不能引起孢子體發(fā)育的任何異常表型，但serk1serk2 雙突變體導致孢子體發(fā)育不完全或雄性不育。serk1serk2 雙突變體

19、的造孢細胞產生小孢子母細胞只能進行減數分裂到四分體時期，隨后母性細胞消失，導致雄性完全不育。,· SERK 參與植物病害防御： OsSERK1 屬于LRR-RLKs之一， 不僅能被稻瘟菌侵染誘導表達，還參與了水稻抗稻瘟菌的反應。水稻受稻瘟菌侵染后，OsSERK1 被誘導表達，且它的表達量與水稻的抗病性有定性關系。,· SERK 可能和植物非減數分裂的孤雌生殖有關：,SERK and APOSTART. Candid

20、ate Genes for Apomixis in Poa pratensis,Plant Physiology, August 2005,SERK 的信號傳導,SERK蛋白具有典型的胞外受體結合域、跨膜結構域和胞內激酶活性結構域等特征，能獨立地完成信號的接收、跨膜轉導和胞內傳遞。,目前， SERK參與的信號傳導途徑研究得最多的是AtSERK3（即BAK1）參與的蕓苔素(brassinosteroid, BR)信號傳導途徑。,AtSE

21、RK3 與BR11 共同接收胞外BR信號，形成同源/異源二聚體或多聚體，抑制BIN2、GSK3 的活性或激活BSU1，改變胞內磷酸化水平及核轉錄因子BZS1和BZR1 的穩(wěn)定性，促進BR調節(jié)基因表達，產生BR生理效應。,SERK 基因小結：,基因結構：,表達特征：,表達調控：,可能功能：,信號轉導：,,LRR—RLK,受到植物生長物質參BAP和NAA以及AMP1蛋白的調控,參與體細胞胚發(fā)生，孢子體發(fā)育，植物病害防御和孤雌生殖等,Dc

22、SERK僅在胚性細胞中表達，其他SERK在非胚性細胞中也有表達,AtSERK3參與的蕓苔素信號傳導途徑,4、植物細胞全能性（組織培養(yǎng)）的應用,4.1 無性系的快速繁殖,快速繁殖是組織培養(yǎng)在生產上應用最廣泛、最成功的一個領域。通常一年內可以繁殖數以萬計的種苗，特別對于名貴品種、稀優(yōu)種質、優(yōu)良單株或新育成品種的繁殖推廣具有重要的意義。 離體繁殖良種種苗最早在蘭花工業(yè)上獲得成功。蘭花成熟的種子中大多數胚不能成活，種子不

23、能發(fā)芽，但通過原球莖組織培養(yǎng)，能使蘭花的繁殖系數大為提高，從而形成了20世紀60年代風靡全球的“蘭花工業(yè)”。其他如牡丹、香石竹和菊花等難以扦插的名貴品種以及無籽西瓜、草莓、獼猴桃、葡萄、菠蘿、柑橘、櫻桃、杉木等的無性系快速繁殖都取得了進展，有力地推動了生產。,4.2 培育無病毒種苗,感病植株的不同部位病毒分布不一致，新生組織及器官病毒含量很低，生長點幾乎不含病毒。這是由于分生組織的細胞生長快，病毒繁殖的速度相對較慢；而且病毒要靠篩管或胞

24、間連絲傳播，在分生組織中的擴散也受到一定的限制。莖尖越小，去病毒機會越大，但分離技術難度大，也較難成活。一般以0.2～0.5mm、帶1～2個葉原基的莖尖為外植體，可獲得無病毒株系。 病毒病常使馬鈴薯減產50%左右。近年，中國馬鈴薯的無病毒種苗栽培面積已超過25萬hm2，約占全國馬鈴薯栽培面積的1/10，目前仍在繼續(xù)擴大之中。另外，在香蕉、蘋果、甘蔗、葡萄、桉樹、毛白楊、草莓、甜瓜、花卉上均通過試管脫毒，建立了試管苗

25、工廠及無病苗圃。,4.3 新品種的選育,1.花培和單倍體育種,花藥和花粉培育的主要目的是誘導花粉發(fā)育形成單倍體植株，以便快速地獲得純系，縮短育種周期、且有利于隱性突變體篩選，提高選擇效率。中國科學院遺傳研究所于1970年獲得第一批水稻花藥培養(yǎng)形成的幼苗，1971年又獲得小麥花藥培養(yǎng)的單倍體植株。近年來已有煙草、水稻、小麥、大麥、玉米和甜椒等一大批花培優(yōu)良新品種在生產上大面積推廣。,花藥培養(yǎng),這是用于克服遠緣雜交不親和的一種有效方法。例如

26、，棉花遠緣雜交雜種胚胎發(fā)育過程中，胚乳生長不正常，致使幼胚分化停止，如將雜交授粉后2～5d的胚珠進行離體培養(yǎng)，可使胚發(fā)育成雜種植株。至今，用胚培養(yǎng)技術已得到許多栽培種與野生種的種間雜種，并選育出一批高抗病、抗蟲、抗旱、耐鹽、優(yōu)質品系或中間材料，從而擴充了作物的基因庫。,2.離體胚培養(yǎng)和雜種植株獲得,3.體細胞誘變和突變體篩選,在離體培養(yǎng)條件下，細胞不受整體的調控直接與環(huán)境接觸，而且培養(yǎng)基中的化學成份和植物激素，又可能含有誘變因素或促進突

27、變的條件，因此植物體細胞在離體培養(yǎng)條件下容易發(fā)生染色體畸變與基因突變。如果再加上物理或化學誘變處理，則誘發(fā)突變的機率更高。 目前，篩選出的突變品系已在十幾種作物的改良中得到了應用。如早熟、豐產的水稻和小麥新品系；高產多穗的玉米新品系以及抗白葉枯病的水稻；抗赤霉病或根腐病的小麥；高賴氨酸含量的玉米和大麥；抗早疫病的番茄；耐枯黃萎病、耐高溫、耐鹽的棉花新品系；抗晚疫病、枯萎病的馬鈴薯突變系以及抗除草劑的煙草品系等等。,4.

28、細胞融合和雜種植株的獲得,細胞融合(cell fusion)是指在一定的條件下，將2個或多個細胞融合為一個細胞的過程。用纖維素酶、半纖維素酶和離析酶等離析細胞以獲得純凈的原生質體。原生質體脫掉了細胞壁后，易于誘導融合，也易于攝取外源遺傳物質、細胞器等。通過原生質體融合可以部分克服遠緣雜交中的不親和性，提供新的核質組合，創(chuàng)造新的細胞雜種，為進一步選種育種擴展新的資源。 目前，已得到栽培煙草與野生煙草、栽培大豆與野生大豆

29、、秈稻與野生稻、秈稻與粳稻、小麥與鵝冠草等細胞雜種及其后代，獲得了有價值的新品系或育種上有用的新材料。,4.4 人工種子,人工種子(artificial seeds) 又稱人造種子或超級種子，是指將植物組織培養(yǎng)產生的胚狀體、芽體及小鱗莖等包裹在含有養(yǎng)分的膠囊內，具有種子的功能并可直接播種于大田的顆粒。人工種子通常由培養(yǎng)物、人工胚乳和人工種皮三部分組成。人工種皮常采用海藻酸鈉、聚氯乙烯、明膠、樹膠等。,制作人工種子首先要培養(yǎng)大批同步生長的

30、、高質量的胚狀體、芽體(不定芽、腋芽、頂芽)等培養(yǎng)物。現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植物的人工種子試種成功。,4.5 藥用植物和次生物質的工業(yè)化生產,植物是許多有用化合物的重要來源，有些尚供不應求。目前植物細胞的大量培養(yǎng)主要用來生產藥物和次生代謝物質，如抗癌藥物、生物堿、調味品、香料、色素等。 運用組織培養(yǎng)生產化學物質可以不受地區(qū)、季節(jié)與氣侯等限制，便于進行代謝調控和工廠化生產，生產

31、速度也比植物正常生長的速度快。例如日本大量培養(yǎng)人參細胞，并從中取得人參皂甙等有效成分，德國培養(yǎng)洋地黃取得療效高、毒性低的強心甙，中國正在進行人參、三七、貝母、紫草、紫杉等藥用植物的細胞培養(yǎng)，其發(fā)展前景十分誘人。,組織培養(yǎng)的應用,,1.無性系的快速繁殖,2.培育無病毒種苗,3.新品種的選育,4.人工種子,5.藥用植物和次生物質的工業(yè)化生產,5、展望,雖然許多植物包括重要的農作物 ，通過原質體培養(yǎng) 、單細胞培養(yǎng) 、花藥或花粉培養(yǎng)和莖尖等組織

32、器官培養(yǎng)能再生植株，但是正如英國諾丁漢大學Cocking教授所說的那樣，當前植物組織培養(yǎng)還是屬于經驗性的工作，植物組織培養(yǎng)在無性繁殖 、植物育種和植物遺傳操作中的應用越 來越 多地取決于了解各種相互作用因素的作用機理 。 植物細胞的全能性表達，即培養(yǎng)細胞和組織的形態(tài)分化受到許多內外界因素的影響，如外植體的種類與生 長 發(fā)育狀態(tài)、培養(yǎng)基成分，特別是植物生長調節(jié)劑、光照與溫度等都影響培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生。進一步揭示植物細胞