馬立克氏病病毒CVI988弱毒疫苗株UL41基因的表達(dá)及鼠抗UL41多抗血清的制備.pdf

1、馬立克氏病病毒的UL41基因與單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus typel，HSV-1)的UL41同源，編碼一種分子量約為50kDa的間質(zhì)蛋白。以往研究表明，HSV-1 UL41蛋白不僅具有核酸酶活性，而且在α皰疹病毒的發(fā)病機(jī)制和免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步研究MDV CVI988弱毒疫苗株的UL41蛋白是否參與逃避宿主免疫，首先對該基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)以及多抗的制備。 一、MDV CVI988

2、毒株UL41基因克隆與分析 設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR方法從MDV CVI988株病毒感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)總DNA中成功擴(kuò)增出UL41基因基因。UL41基因序列分析表明，該基因在MDV-1中高度保守，核酸序列同源性在99.8％以上，氨基酸序列同源性在99.3％以上；并發(fā)現(xiàn)該基因中也具有和真核細(xì)胞核酸酶類似的XPGI結(jié)構(gòu)域。 二、MDV CVI988毒株UL41基因原核表達(dá)及其多抗研制 利用原核表達(dá)載體p

3、GEX-6P-1構(gòu)建UL41基因與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)子，命名為pGEX-UL41。pGEX-UL41經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE電泳和Western blot證實(shí)UL41基因得到成功表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。利用電洗脫法成功獲得融合目的蛋白，并以其蛋白為抗原免疫小鼠，制備了抗MDV CVI988毒株UIA1蛋白特異性多克隆抗體。 三、MDV CVI988毒株UL41基因桿狀病毒真核表達(dá)

4、 通過將UL41基因ORF克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacl中，獲得的重組質(zhì)粒pFastBacl-UL41，并將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞；通過藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定，獲得重組桿狀病毒rBacmid-UL41重組DNA。rBacmid-UL41重組DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-UL41。并利用原核表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備的多抗血清，通過間接免疫熒光試驗(IFA)和Western blot證明了MDV CV