荷載干細胞的TGF-β3-地塞米松-PLGA微球用于退變椎間盤的研究.pdf

1、背景：
　　椎間盤(The intervertebral disc，IVD)由層狀纖維環(huán)（annulus fibrosus，AF）包裹的髓核(nucleus pulposus，NP)構(gòu)成。髓核中有大量的椎間盤相關(guān)基質(zhì)蛋白，是由負電荷蛋白聚糖(proteoglycans，PG)和Ⅱ型膠原形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。椎間盤在許多情況下都會發(fā)生退變，臨床上極為常見，給國家醫(yī)療花費增加了沉重的負擔(dān)。現(xiàn)有文獻證明，代謝因素如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix

2、 metalloproteinases，MMPs)，細胞凋亡，炎癥相關(guān)細胞因子都會加速椎間盤的退變。目前臨床上針對椎間盤都以對癥治療為出發(fā)點，以減輕痛苦和修補功能為目標，并沒有對椎間盤病變進行根治或是對其在生物力學(xué)功能上進行修復(fù)。對于椎間盤的修復(fù)，針對退變早期，新型的生物學(xué)治療方案是對椎間盤的基質(zhì)進行再生以及正常功能的全面恢復(fù)。體外研究顯示，TGF-β1，BMP-7，GDF-5和TGF-β3等生長因子會刺激椎間盤細胞的增殖及提高細胞外基

3、質(zhì)的合成能力。雖然一些研究提示GDF-5和BMP-7會椎間盤的退變產(chǎn)生抑制作用，但Walsh等的研究中，退變椎間盤的環(huán)狀纖維只有對大劑量TGF-β1的體內(nèi)注射產(chǎn)生即時效應(yīng)，這些生長因子在體內(nèi)短暫的半衰期成為阻礙生長因子治療效果的瓶頸。微創(chuàng)治療的微粒組裝系統(tǒng)不但可以作為細胞和蛋白質(zhì)緩釋載體，而且在可以用于各種微創(chuàng)組織工程研究。明確的生物組織相容性和安全性，使得PLGA微球作為組織相容復(fù)合物被廣泛應(yīng)用于各種各樣的生物組織工程研究。但是，培養(yǎng)

4、在PLGA微球上的椎間盤細胞和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcells，MSCs)，在常規(guī)培養(yǎng)基條件下常常從軟骨樣細胞表型的干細胞分化為成纖維樣細胞。因此，一些試驗都在嘗試著在椎間盤內(nèi)髓核組織分化中，將特殊的生長因子和藥物包裝到PLGA微球上。在材料表面修飾的過程中，納米顆粒在空間上可以被有序加工，用其制作的各式各樣新型材料已被用于光學(xué)，電學(xué)，磁學(xué)設(shè)備，此外，生物支架材料的表面修飾可以增加細胞表面的相互作用增強細胞功能。

5、值得一提的是，不同電荷的納米微粒的層層組裝(layer-by-layer assembly， LBL)已經(jīng)用于新型納米復(fù)合材料的制作，而且納米多層結(jié)構(gòu)材料也已經(jīng)用于細胞培養(yǎng)和細胞移植?；谏鲜鲅芯窟M展，本課題主要從以下五個方面進行了研究:(1)SD ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定;SD GFP/ADSCs和SD TGF-β3/ADSCs過表達細胞系的構(gòu)建和鑒定;(2)椎間盤微環(huán)境對不同年齡來源ADSCs的活力、增殖和基質(zhì)合成的影響;(3)

6、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球的制備及對SD ADSCs活性、增殖及分化能力的研究;(4) DEX/TGF-β3/PLGA納米微球/SD ADSCs復(fù)合物移植修復(fù)SD大鼠退變椎間盤的研究。
　　第一部分、SD ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定;SD GFP/ADSCs和SDTGF-β3/ADSCs過表達細胞系的構(gòu)建和鑒定
　　目的：分離培養(yǎng)出SD大鼠ADSCs，然后通過三系分化和流式細胞術(shù)鑒定其干細胞特征。構(gòu)建攜帶TGF-

7、β3和GFP基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染到ADSCs，進而藥物篩選獲得GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs細胞系，同樣鑒定其干細胞特征，為椎間盤退變性疾病的細胞學(xué)及基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：我們首先采用機械剪碎組織，酶消化和貼壁法分離培養(yǎng)出SD大鼠ADSCs，通過研究干細胞形態(tài)，生長曲線，表面抗原標記表達譜及三系分化能力，對分離的ADSCs進行鑒定。然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶TGF-β3和GFP基因的慢病毒

8、載體，轉(zhuǎn)染到ADSCs，進而藥物篩選獲得穩(wěn)定表達TGF-β3和GFP基因的細胞系GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs。最后，本文按照干細胞形態(tài)，表面抗原標記表達譜及三系分化能力，對細胞系GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs進行鑒定;同時利用RT-PCR和Western Blot檢測TGF-β3基因在三種細胞系A(chǔ)DSCs，GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs中的表達情況。體外成功建立SD大鼠ADSCs培養(yǎng)擴增的方法

9、，并成功誘導(dǎo)出成骨、成脂和成軟骨細胞。ADSCs造血干細胞表型標志表達為陰性，而間充質(zhì)干細胞表型標志表達為陽性?；蜣D(zhuǎn)染48h后觀察到較強的綠色熒光表達，Lenti-GFP-TGF-β3及Lenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達到90％以上。與GFP/ADSCs和ADSCs細胞相比，RT-PCR、Western blot檢測到目的基因TGF-β3在TGF-β3/ADSCs中出現(xiàn)過表達(P＜0.05)。此外，GFP/ADSCs和TGF-β3/ADS

10、Cs細胞系仍然具有干細胞特征。
　　結(jié)論：分離培養(yǎng)出的SD大鼠ADSCs體外培養(yǎng)擴增容易，具有多向分化潛能和間充質(zhì)干細胞特征。成功構(gòu)建了含有TGF-β3基因慢病毒載體，轉(zhuǎn)染ADSCs后，建立了GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs細胞系。
　　第二部分、椎間盤微環(huán)境對不同年齡來源ADSCs的活力、增殖和基質(zhì)合成的影響
　　目的：人脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)可能是椎間盤再生細胞的理想種子細胞，但惡劣微環(huán)境是否會

11、改變ADSCs生物活性和代謝活力，最終削弱它們的修復(fù)潛力。因此，本章主要研究人ADSCs在正常和退變椎間盤微環(huán)境條件下的活力，增殖能力及主要基質(zhì)蛋白的表達情況。
　　方法和結(jié)果：分別從兒童（年齡在8-12歲，n=6）和成人（年齡33-42歲，n=6）男性捐助者脂肪中培養(yǎng)ADSCs，然后把它們在標準培養(yǎng)基和模擬椎間盤微環(huán)境（低糖，酸性，高滲透壓和混合環(huán)境）的條件下培養(yǎng)2周。Annexin V-FITC(AV-PI)流式細胞術(shù)方法檢測

12、細胞生物活性，而細胞增殖率測定采用MTT法檢測。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot分析檢測蛋白多糖，膠原蛋白-Ⅰ和膠原蛋白-Ⅱ基因表達的情況。模擬椎間盤微環(huán)境的低糖培養(yǎng)條件不但可以保證ADSCs的活力和以較低的正常水平增殖，而且可以提高ADSCs合成蛋白聚糖的能力，所以我們推測椎間盤內(nèi)的低糖條件可能對ADSCs移植治療椎間盤退變是一個有利因素。相反，模擬椎間盤微環(huán)境的高滲透壓和低pH值微環(huán)境，損害ADSCs活

13、力，降低ADSCs增殖速度和基質(zhì)合成能力。此外，供體年齡差異對ADSCs的在椎間盤微環(huán)境中活力和增殖的影響甚微。
　　結(jié)論：對體外培養(yǎng)的ADSCs存活和增殖而言，低糖培養(yǎng)條件是其有利因素，而高滲透壓和酸性環(huán)境是其有害因素。這些研究結(jié)果有利于促進ADSCs用于下腰痛的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。
　　第三部分、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球的制備及對SD ADSCs活性、增殖及分化能力的研究
　　目的：這項研究旨在確定利用層層

14、組裝方法把肝素/多聚L-賴氨酸/生長因子與包埋地塞米松的PLGA微球上，然后評估該三維納米PLGA微球作為髓核組織工程支架的可行性。
　　方法和結(jié)果：我們的結(jié)果證明PLGA微球結(jié)構(gòu)可以在近似零級動力條件下同時釋放TGF-β3生長因子和地塞米松。經(jīng)過乳酸脫氫酶(LDH)檢測和CCK-8檢測得知，雙重緩釋的PLGA微球?qū)DSCs沒有細胞毒性，，其還可促進SDADSCs的增殖。體外4周培養(yǎng)后，PLGA微球組的ADSCs細胞的GAG/D

15、NA和Ⅱ型膠原表達顯著高于對照組。此外，定量實時PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PLGA微球組培養(yǎng)的ADSCs有較高水平的Ⅱ型膠原，聚集蛋白聚糖及多能聚糖的表達，但是成骨分化標記物（Ⅰ型膠原）含量較低。
　　結(jié)論：綜上，DEX/TGF-β3/PLGA微球可應(yīng)用于髓核組織工程中，不但作為支架促進ADSCs細胞生長并促進向髓核樣細胞進化，而且降低局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)。
　　第四部分、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球/SD A

16、DSCs復(fù)合物移植修復(fù)SD大鼠退變椎間盤的研究
　　目的：下腰痛常常是由椎間盤髓核退變引起的。組織工程是一個功能強大的治療模式，其以恢復(fù)人脊柱正常的生物力學(xué)運動功能為目的。第三章我們報道了一個新的納米結(jié)構(gòu)的3D PLGA微球，體外研究發(fā)現(xiàn)，這種通過層層組裝地塞米松和生長因子到3D PLGA微球，可以控釋兩種生物活性因子，是一種優(yōu)良的髓核組織工程的細胞載體。本章研究的目的是調(diào)查移植3D PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物到大鼠椎間盤退

17、變模型，是否可以再生退化的椎間盤。
　　方法和結(jié)果：大鼠共分為四組:正常對照組（NC組，無操作），退交對照組(DC組，針刺操作)，PLGA微球治療組（PM組，針刺操作+PLGA微球移植），PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物治療組（PMA組，針刺操作+PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物移植）。分別在移植后的第4、8、16和24周，對四組大鼠椎間盤行X先平片檢測椎間盤高度的變化，T2加權(quán)磁共振成像(MRI)檢查，組織學(xué)染色和評分，免疫組化

18、和RT-PCR檢測相關(guān)基因表達情況。結(jié)果表明，移植24周后，以NC組為正常參照，PM和PMA組的椎間盤平均高度值分別約為63％和76％，MRI信號強度分別約47％和76％。生物化學(xué)，免疫組織化學(xué)和基因表達分析表明在PM和PMA組椎間盤有較多的蛋白多糖積累。
　　結(jié)論：這些數(shù)據(jù)表明，在大鼠椎間盤退變模型中，移植3D PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物能在一定程度再生退化的椎間盤。PLGA微球在細胞移植治療椎間盤退變性疾病可能會是一種很