漢坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步確定.pdf

1、目的: 已有計(jì)算機(jī)程序的分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示漢坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白，而且屬于Ⅱ類融合蛋白，而內(nèi)在的結(jié)構(gòu)區(qū)（aa763～785）很可能是介導(dǎo)膜融合的關(guān)鍵部位--融合肽。另外，已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持漢坦病毒的融合肽位于糖蛋白G2而不是G1上。鑒于漢坦病毒GM04-38株也存在上述保守區(qū)（aa763～785），本研究擬通過實(shí)驗(yàn)對(duì)此保守區(qū)是否為其融合肽做出初步判斷。從而為闡明HV的細(xì)胞融合機(jī)制、研制有效的漢坦病毒新型疫苗和治療制劑奠定基礎(chǔ)。

2、 方法: 根據(jù)GM04-38株M片段cDNA基因序列應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，同源重組PCR法構(gòu)建10個(gè)單個(gè)氨基酸突變的糖蛋白G2的克隆載體。PCR擴(kuò)增糖蛋白突變體的G2編碼區(qū)基因，雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAGGS/MCS連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，氨芐青霉素篩選糖蛋白G2單個(gè)氨基酸突變體的表達(dá)載體。經(jīng)雙酶切和測(cè)序證實(shí)。然后將野毒株G1Bg1與GmG2/某糖蛋白G2突變體表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，間

3、接免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，并經(jīng)酸性MEM處理、Giemsa染色后觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)生。 結(jié)果: 1．構(gòu)建了10個(gè)糖蛋白G2單個(gè)氨基酸突變的克隆載體C765A、P767D、P768D、C770A、P771D、G772D、G774D、G776D、C777A、C780A，雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1．6kb和2．7kb，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。 2．構(gòu)建了10個(gè)糖蛋白G2單個(gè)氨基酸突變的表達(dá)載體GmG2-C765A、Gm

4、G2-P767D、GmG2-P768D、GmG2-C770A、GmG2-P771D、GmG2-G772D、GmG2-G774D、GmG2-G776D、GmG2-C777A、GmG2-C780A，雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1．6kb和4．7kb，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。 3．間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉(zhuǎn)染組、G1Bg1與某糖蛋白G2突變體表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組均有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生，呈胞漿分布。 4．野毒株G1B