Wnt-β-catenin信號途徑及ILK在糖尿病性腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見并發(fā)癥，是引起終末期腎衰的主要原因之一，其主要病理變化為腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)聚集、腎小球硬化、腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化等。以往對DN的研究大多集中在腎小球病變，而對腎小管間質(zhì)病變的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究較少。近來越來越多的研究表明糖尿病腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與腎功能的進(jìn)行性下降密切相關(guān)。高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，分泌并聚集細(xì)胞外基質(zhì)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生。

2、糖尿病腎病小管間質(zhì)病變是決定其腎功能下降水平及預(yù)后的重要因素。
　　 Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號途徑參與細(xì)胞增殖、分化、存活、凋亡及細(xì)胞遷移等多種功能的調(diào)控，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和器官纖維化等重要生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明Wnt/β-catenin信號途徑調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡過程，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎臟該途徑表達(dá)上調(diào)，提示此途徑可能參與了慢性腎臟病的發(fā)病。
　　 整

3、合素連接激酶（ILK）被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）下游最重要的致纖維化因子之一。在慢性腎臟病、糖尿病腎病及UUO模型梗阻側(cè)腎臟均發(fā)現(xiàn)ILK過度表達(dá)加重細(xì)胞外基質(zhì)的積聚及腎臟纖維化的程度。ILK過度表達(dá)可激活Wnt信號通路下游分子，也就是說通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）活性促使β-catenin核聚集。ILK可能通過與Wnt信號途徑“串話（cross talk）”而參與了腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病。
　　 在糖

4、尿病腎臟病變中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用及該途徑與ILK的關(guān)系尚有許多未知。本研究應(yīng)用糖尿病大鼠模型和體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（HKC），系統(tǒng)觀察了Wnt/β-catenin信號途徑及ILK在早期糖尿病腎病以及高糖誘導(dǎo)HKC轉(zhuǎn)分化中的表達(dá)；用ILK小干擾RNA（ILKsiRNA）沉默ILK基因表達(dá)，觀察了Wnt/β-catenin途徑下游因子在高糖誘導(dǎo)HKC轉(zhuǎn)分化過程中的變化；并結(jié)合糖尿病腎病患者腎臟Wnt/β-

5、catenin信號途徑表達(dá)的變化，以進(jìn)一步探討Wnt途徑在糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。以期為進(jìn)一步闡明糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.大鼠糖尿病模型的制備和ILK、Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白及mRNA的檢測
　　 Wistar雄性大鼠均行右腎切除術(shù)，傷口愈合后隨機(jī)分為對照組（CG）和糖尿病組（DM），DM組大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素6

6、5mg/kg（STZ溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5），對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48h后測定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者確定為DM模型。成模后4、8、12周每組取6只大鼠，切取腎臟。取部分腎皮質(zhì)組織置于4％多聚甲醛固定，用光鏡及免疫組織化學(xué)染色法檢測，免疫組化檢測指標(biāo)包括ILK、Wnt4、β-catenin、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達(dá)；取部分腎皮質(zhì)組織提取總

7、蛋白及核蛋白，Western blot檢測ILK、Wnt4、β-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β蛋白（P-GSK-3β）表達(dá)；取部分腎皮質(zhì)組織提取總RNA，半定量RT-PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)和ILK、Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白及mRNA的檢測體外培養(yǎng)HKC，無血清DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，細(xì)胞分成3組：正常糖組（NG，D-Glucose5

8、.5mmol/L），甘露醇對照組（NG+M，D-Glucose5.5 mmol/L+mannitol24.5 mmol/L），高糖組（HG，D-Glucose30 mmol/L），培養(yǎng)12、24、48、72h后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白、核蛋白及RNA。采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Wnt4、β-catenin及E-鈣粘蛋白（E-cadherin），α-SMA的表達(dá)；Western blot檢測ILK、Wnt4、GSK-3β、P-GSK-3β、β-c

9、atenin蛋白的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞Wnt4、GSK-3β及β-catenin mRNA的水平。
　　 3.HKC ILKsiRNA轉(zhuǎn)染及ILK、GSK-3β、β-catenin表達(dá)的檢測
　　 針對HKC ILK編碼序列分別設(shè)計3條體外轉(zhuǎn)錄的shRNA。應(yīng)用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將Pgenesil-1.1-ILKsiRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HKC，分成6組：①正常對照組（NG）；②高糖

10、組（HG）；③高糖+陰性轉(zhuǎn)染對照組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-HK（HG+HK）；④高糖+pGenesil-1.1-ILK-1（HG+ILK-1siRNA）組；⑤高糖+pGenesil-1.1-ILK-2（HG+ILK-2siRNA）組；⑥高糖+pGenesil-1.1-ILK-3（HG+ILK-3siRNA）組。轉(zhuǎn)染48h熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)。Western-blot及RT-PCR檢測ILK蛋白及RNA

11、表達(dá)水平，確定敲低效果最佳的ILK siRNA。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測P-GSK-3β、β-catenin表達(dá)。Western blot檢測GSK-3β、P-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin和α-SMA表達(dá)。
　　 4.病例選擇及腎組織Wnt4、P-GSK-3β、β-catenin的表達(dá)的檢測
　　 選擇2006.10-2008.10在河北醫(yī)大二院腎內(nèi)科住院、經(jīng)臨床與腎活檢診斷為糖尿病腎病患者33例（其

12、中男性18例，女性15例，年齡28-70歲，48.7±10.3歲）。除外狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、甲狀腺病相關(guān)性腎損害、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎腎損害以及腫瘤相關(guān)性腎病等繼發(fā)性腎臟病患者，并除外合并急性。腎小管壞死和急、慢性間質(zhì)性腎炎的患者。糖尿病腎病患者根據(jù)腎小管間質(zhì)病變程度分為兩組，輕中度組20例，重度組13例。10例腎腫瘤患者遠(yuǎn)離腫瘤的正常腎組織作為對照。詳細(xì)收集患者臨床資料，包括年齡、病程、血漿白蛋白、24小時尿蛋白定量

13、、血肌酐等。免疫組化法檢測Wnt4、P-GSK-3β、β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Wnt/β-catenin信號途徑在糖尿病腎病早期以及高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中表達(dá)增高，該途徑可能參與了糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。
　　 2.ILK在糖尿病腎病早期腎小管間質(zhì)病變及高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中表達(dá)增高；轉(zhuǎn)染HKC ILKsiRNA能成功沉默ILK基因，使P-