粘球菌內(nèi)源質粒的發(fā)現(xiàn)、復制區(qū)性質和應用.pdf

1、粘細菌是一類革蘭氏陰性桿狀細菌，在分類上屬于變形菌門的δ分支。粘細菌是一種高等的原核生物，具有復雜的多細胞社會性行為，主要表現(xiàn)為介質表面的滑動運動、復雜的子實體形態(tài)發(fā)生和細胞生長的密度依賴性，因此粘細菌是研究細菌細胞間通訊、多細胞形態(tài)發(fā)生和生物進化的重要模式生物。此外粘細菌可以產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物.已成為繼放線菌之后的一類重要的藥源微生物。而且粘細菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有種類多、結構新、具有菌株特異性、衍生物眾多和作

2、用于真核細胞的獨特特點，吸引了越來越多不同研究領域的科學家的關注。但是由于粘細菌繁瑣費時的分離純化方法和不完善的遺傳操作技術，該微生物的研究和應用受到了極大的限制。 由于粘細菌作為生境中的捕食者，細胞內(nèi)存在大量的蛋白酶和核酸酶，且粘細菌生長存在細胞密度依賴性，對粘細菌進行遺傳操作遇到了很多困難。經(jīng)過過去三十年的研究，常用的遺傳學操作方法(轉導、轉化和接合)已在粘細菌的模式菌株中得到了成功應用。然而在過去近五十年的時間中，科研工作

3、者雖然對粘細菌進行了大規(guī)模篩選，但是在各種屬細胞中一直沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的質粒，而且其他菌目來源的廣宿主范圍質粒均不能在粘細菌中自主復制，所以粘細菌的遺傳學研究受到了極大限制。本論文試圖對中國生境內(nèi)已分離的粘細菌進行篩選，希望能篩選到帶有自主復制質粒的粘細菌，并將質粒應用于粘細菌的遺傳學研究，建立新的遺傳學操作方法。 本論文采用放線菌中常用的質粒篩選方法，利用脈沖場電泳和瓊脂糖凝膠電泳技術對本實驗室分離的150株粘球菌和珊瑚球菌菌株

4、進行線性質粒和環(huán)形質粒的篩選。結果顯示沒有篩選到線性質粒，但在一株Myxococcus fulvus 124B02中發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)形的內(nèi)源質粒pMF1。該菌能形成典型的粘球菌子實體結構，且16S rDNA序列與M.fulvus ATCC 25199的16S rDNA序列具有99％的同源性，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為M 206081。對質粒pMF1亞克隆測序發(fā)現(xiàn)，該質粒序列全長18,634 bp，G+C％含量為68.7％。ORF預測顯示

5、全序列存在23個可能的ORF，其中21個ORS位于正義鏈，2個ORS位于反義鏈：9個ORF與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列有較高同源性，其余的14個ORF同源性較低，是未知功能蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)可能的質粒復制起始蛋白。本論文構建了一個帶有卡那霉素抗性篩選標記的克隆載體pZJY1，用于在M.xanthus中定位pMF1的質粒復制功能區(qū)。結果顯示凡是帶有pMF1.14基因的質粒，轉化M. xanthus的轉化子均可以耐受卡那霉素，且存在核外自

6、主復制質粒。質粒的電轉化效率高于同源重組質粒的電轉化效率，轉化M. xanthus DZ1可達到1×106 CFU/μg DNA，轉化M.xanthus DK.1622可達到1×105CFU/μg DNA，推測PMF1.14就是pMF1的質粒復制起始蛋白，而質粒pZJY15中帶有的pMF1插入序列(11，645-13,853 bp)可能就是pMF1質粒復制功能區(qū)。在E. coli中對pMF1.14基因進行異源表達，結果顯示除pQE-30

7、構建的質粒外，其他載體構建的質粒均可使轉化子經(jīng)過誘導產(chǎn)生目的大小的表達產(chǎn)物，以可溶性蛋白和包涵體的形式存在。 本論文發(fā)現(xiàn)構建的質粒在M. xanthus轉化子中結構不穩(wěn)定，會小于原始質粒大小，通過克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，質粒中的不穩(wěn)定區(qū)域是E.coli質粒pSP72的復制子與氨芐青霉素抗性基因bla序列，推測E. coli質粒pSP72的復制子與M.fulvus質粒pMF1的復制子在M. xanthus中不能共存。為了解決這個問題，對

8、帶有兩種復制子質粒的M. xanthus轉化子進行了大量篩選，篩選到兩個在M. xanthus中結構穩(wěn)定的質粒pZJY41和pZJY156。而且在抗性篩選壓力下，M. xanthus轉化子連續(xù)傳代，兩質粒結構依然穩(wěn)定，克隆測序分析發(fā)現(xiàn)兩個質粒帶有的pMF1插入序列部分均有1個堿基的缺失。 本論文在M. xanthus中對穿梭載體pZJY41和pZJY156進行了性質測定，這兩個質粒在M. xanthus中均為低拷貝質粒，在M.

9、xanthus DZ1中pZJY41的拷貝數(shù)為13左右，pZJY156的拷貝數(shù)低于pZJY41；而在M. xanthus DK1622中pZJY41和pZJY156的拷貝數(shù)要低于其各自在M. xanthus DZ1中的拷貝數(shù)。質粒pZJY41和pZJY156在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性很差，在沒有選擇壓力的情況下，傳代42代后質粒在轉化子中的存在率降為5％以下。為提高穿梭載體在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性，來自質粒pMF1

10、的兩個ORF基因pMF1.16(推測的重組酶基因)和pMF1.22(推測的分配蛋白parA基因)克隆入兩個穿梭載體，獲得的質粒在M. xanthus中的遺傳穩(wěn)定性依然很差，推測自主復制質粒在M.xanthus中的分配可能依賴其他機制或蛋白的作用。構建的帶有pMF1復制子的接合質粒接合入Sorangium cellulosum So0157-2，與同源重組質粒相比接合效率提高10-100倍，但是質粒的遺傳穩(wěn)定性非常差，推測與S. cell

11、ulsoum中更為嚴格的限制修飾系統(tǒng)相關。為將pZJY41和pZJY156這兩個穿梭載體應用于粘細菌的遺傳學研究，本論文開展了兩方面的工作，試圖在粘細菌中建立一套新的遺傳操作方法。 粘細菌的滑動運動在Myxococcus xanthus中研究得較為成熟，受雙運動系統(tǒng)控制：細胞的群體運動(S運動)和細胞的個體運動(A運動)。兩種運動在含有不同濃度瓊脂的平板表面表現(xiàn)出不同的選擇優(yōu)勢，易于區(qū)分。其中細胞的群體運動機制研究得較為透徹，主

12、要依賴細胞表面的IV型菌毛、胞外纖絲和脂多糖O抗原三種組分。S運動的動力元件是IV型菌毛，依靠IV型菌毛的伸展、粘附、收縮拉動細胞共同運動，而pilA基因是菌毛pili的結構基因。本論文將M. xanthusDK1622來源的pilA基因及上游的σ54啟動子序列克隆入穿梭載體pZJY41和pZIY156構建功能質粒，轉化pilA基因缺失的S運動缺失突變體M. xanthusDK10410。通過透射電鏡觀察，轉化子細胞極處長出pili；運

13、動學實驗表明，轉化子S運動表型恢復。實驗表明應用穿梭質粒時，克隆目的基因的轉錄方向與pMF1質粒復制起始蛋白的轉錄方向必須一致，M. xanthus轉化子中質粒結構穩(wěn)定。該實驗證明穿梭載體pZJY41和pZJY156可以成功應用于粘細菌的遺傳學研究，在M. xanthus中建立了以核外質粒形式回補缺失基因的新的遺傳學操作方法。 氨基糖甙類抗生素是一種重要的臨床藥用抗生素，微生物對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生的抗性機制除了常見的改變細胞通

14、透性、活性外排、靶點核酸替換及三種修飾氨基糖甙類抗生素的酶失活抗生素以外，又發(fā)現(xiàn)了一類對rRNA修飾的酶：16S rRNA甲基化酶和16S rRNA甲基轉移酶。這類酶可以使細胞對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生廣譜抗性，多由氨基糖甙類抗生素的產(chǎn)生菌株編碼產(chǎn)生，對rRNA甲基化修飾破壞抗生素與核糖體亞單位中16S rRNA的特異性結合。近年來該酶也在一些氨基糖甙類抗生素耐藥菌中發(fā)現(xiàn)。 粘細菌可以對多種抗生素產(chǎn)生抗性，多表現(xiàn)為菌株特異性，而S.

15、cellulosum對氨基糖甙類抗生素——卡那霉素的耐受性具有種特異性，但由于粘細菌中有限的遺傳學研究方法，該抗性機制的遺傳學基礎一直沒有闡明，本論文試圖利用pMF1復制子在M. xanthus中研究S. cellulosum對卡那霉素具有內(nèi)源抗性的遺傳學基礎。本論文構建了一個在M. xanthus中沒有篩選標記但帶有pMF1復制子的克隆載體pZJY42，將不完全酶處理的S. cellulosum So0157-2的染色體片段克隆入pZ

16、JY42轉化M. xanthus DZ1，在卡那霉素抗性平板上篩選到5株M. xanthus轉化子。對克隆序列進行序列測定和組裝，得到5.4 kb的S. cellulosum基因組片段，且各轉化子中均帶有一段2.4 kb的共有序列。對卡那霉素抗性基因進行基因定位，發(fā)現(xiàn)該基因是一個推測的rRNA甲基轉移酶基因，位于一個672 bp的基因位點kmr(kanamycin resistance)。凡是帶有該位點的質粒均能使M.xanthus轉化

17、子對卡那霉素、慶大霉素、阿布拉霉素、新霉素和妥布霉素產(chǎn)生高水平的抗性(大于500 μg/ml)。但是帶有該位點的質粒卻不能使E. coli轉化子對卡那霉素產(chǎn)生抗性，推測可能由于該基因的啟動子序列不能為E. coli識別轉錄，或基因中帶有的E. coli稀有密碼子不能有效翻譯。在S. cellulosum基因組序列中，kmr位點下游存在一個推測的整合酶基因，可能幫助kmr在S.cellulosum種間傳播。利用16S rRNA甲基轉移酶保