細胞膜微結構域（脂筏）-Flot調控MAPK激酶及逆轉肝癌細胞耐藥性的研究.pdf

1、目的:
　　1.構建耐藥肝癌細胞模型。
　　2.檢測Flot下調對ERK1/2信號通路的影響，明確能否通過Flot調控ERK1/2信號通路從而實現(xiàn)肝癌細胞耐藥性的逆轉。
　　3.檢測脂筏破壞劑甲基-β-環(huán)糊精破壞脂筏結構對ERK1/2的影響，探索脂筏與ERK1/2之間的關聯(lián)。
　　4.檢測下調Flot對耐藥肝癌細胞侵襲能力的影響。
　　5.構建過表達質粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcD

2、NA3.1(+)，為后續(xù)研究工作奠定基礎。
　　方法:
　　1.用阿霉素大劑量沖擊法誘導細胞，Celltiter-Glo熒光細胞活性檢測法檢測細胞對阿霉素的敏感性。
　　2.設計siRNA和shRNA，Real-Time-PCR和Western Blotting篩選出對Flot的下調效果更佳的方法。后續(xù)實驗采用該方法下調Flot; Western Blotting方法檢測各組細胞中C-RAF、MEK1/2、ERK1/2

3、的表達水平。
　　3.用脂筏破壞劑甲基-β-環(huán)糊精破壞脂筏結構，激光共聚焦顯微鏡驗證其作用效果，Western Blotting方法檢測脂筏破壞后細胞內ERK1/2的表達水平。
　　4.體外劃痕實驗檢測Flot下調后細胞越過劃痕區(qū)距離的變化。
　　5.PCR擴增Flot序列，將其插入pcDNA3.1(+)真核表達載體，構建重組質粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcDNA3.1(+)。
　　結果:

4、
　　1.阿霉素誘導得到的兩株肝癌細胞株SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM耐藥指數(shù)分別為16.44和20.34，符合高度耐藥。
　　2.與shRNA方法比較，siRNA方法沉默效率更高，故后續(xù)實驗選用siRNA干擾的方法下調Flot。與對照組相比，實驗組細胞磷酸化C-RAF，磷酸化MEK1/2表達水平水平明顯降低，且siRNA轉染時間越長，下調效果越明顯;非磷酸化C-RAF，MEK1/2表達水平未受明顯影響

5、。磷酸化ERK1/2表達水平先短暫升高后逐漸降低，最后明顯低于對照組水平;非磷酸化ERK1/2表達未受明顯影響。
　　3.與對照組相比，經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精作用后的實驗組細胞在共聚焦顯微鏡下觀察到的綠色熒光明顯減少，且其磷酸化ERK1/2顯著降低。
　　4.siRNA轉染后的細胞組比對照組細胞越過劃痕區(qū)距離明顯縮短。
　　5.重組質粒Flot1/pcDNA3.1(+)、Flot2/pcDNA3.1(+)轉入細胞后Flot

6、-1、Flot-2表達水平明顯升高。
　　結論:
　　1.成功構建耐藥肝癌細胞模型SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM。
　　2.下調Flot后ERK1/2信號通路被抑制，這為通過Flot調控ERK1/2信號通路從而實現(xiàn)耐藥性的逆轉提供理論依據(jù)。
　　3.脂筏參與調控ERK1/2的激活。
　　4.Flot的表達水平影響肝癌細胞侵襲能力。
　　5.成功構建過表達質粒Flot1/pcDNA