錳對心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、活性氧以及細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、錳是生物體必需的微量元素之一，作為一些生物物質(zhì)的組成部分和一些酶類的活性基團(tuán)，參與多種生理反應(yīng)。但過量的接觸錳會對機(jī)體造成多種不良影響。其中對心臟功能的損傷是其毒性作用中重要的一部分。有大量文獻(xiàn)表明錳的心臟毒性作用，對其心臟毒性的研究涉及臨床、器官、組織等各個方面。但是對其作用機(jī)制的研究還很欠缺，尤其是在細(xì)胞和分子水平的研究。本論文詣在對錳的心肌毒性在細(xì)胞水平的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究探討。實(shí)驗(yàn)主要圍繞心肌細(xì)胞L-型鈣通道和鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞內(nèi)

2、活性氧水平的變化和細(xì)胞凋亡三方面展開。 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用電生理學(xué)研究儀器膜片鉗，采用全細(xì)胞記錄模式研究了錳對心肌細(xì)胞L-型鈣通道的作用。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞L-型鈣通道是錳的作用靶點(diǎn)之一，50μM Mn<'2+>和100μM Mn<'2+>可以使細(xì)胞的跨膜電流密度降低35.7％和68.2％。而且，在錳離子作用下，L-型鈣通道的穩(wěn)態(tài)激活時間推遲和穩(wěn)態(tài)失活時間提前，各項(xiàng)參數(shù)都有不同程度的變化。因?yàn)樾纬蒐-鈣通道孔蛋白的α1亞基的表達(dá)水平與通道

3、電流的密度有密切關(guān)系，并且對通道開放關(guān)閉的性質(zhì)也有決定作用，所以我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測了兩類心肌α1亞基α1C/Cav1.2和α1D/Cav1.3mRNAs在錳離子作用下的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α1C/Cav1.2 mRNA的表達(dá)隨著錳離子濃度的升高而降低，而α1D/Cav1.3 mRNA的表達(dá)幾乎不受錳離子的影響。應(yīng)用共聚焦顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行連續(xù)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)錳離子可以使細(xì)胞內(nèi)鈣熒光發(fā)生一個緩慢的、連續(xù)的升高，并且隨著毒害離子

4、濃度的升高，趨勢也愈加強(qiáng)烈。研究結(jié)果明確表明錳離子對心肌細(xì)胞L-型鈣通道的具有抑制作用，還可以導(dǎo)致其相關(guān)蛋白亞基α1c/Cavl.2分子水平的減少，由此進(jìn)一步加強(qiáng)了錳離子對L-型鈣通道的負(fù)性作用。細(xì)胞內(nèi)的鈣超載可能介導(dǎo)了基因表達(dá)的調(diào)控過程，可能來源于細(xì)胞內(nèi)鈣庫的釋放，也說明L-型鈣通道的功能異常會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的變化。 實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡對錳離子作用下心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧變化以及對線粒體膜電位的影響進(jìn)行了研究。結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)錳可以使心肌細(xì)胞內(nèi)的總的氧化水平升高，其中過氧化氫為主要升高的活性氧。還發(fā)現(xiàn)錳離子作用下心肌細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽含量發(fā)生明顯下降，在GSH-EE存在下，過氧化氫含量又明顯降低，說明錳離子導(dǎo)致的過氧化氫的過量積累主要原因是由于細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的減少導(dǎo)致了對過氧化氫的清除速度減慢。也說明GSH-EE可以有效的清除細(xì)胞內(nèi)過量的過氧化氫。錳離子還可以使心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降，而且在高濃度錳離子作用下膜電位下降更加明顯，當(dāng)谷胱甘肽增加的情況

6、下，膜電位又有很明顯的恢復(fù)，表明過量的過氧化氫可能參與了對線粒體膜的損傷。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明錳離子對心肌細(xì)胞的氧化傷害主要是由于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的降低導(dǎo)致了過氧化氫的過量積累，因此造成對線粒體膜的傷害，造成膜電位的降低。錳離子還可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生。通過測定線粒體脫氫酶活性確定錳離子可以引起NRVM的細(xì)胞毒性反應(yīng)，當(dāng)以0、50、100、500和1500μM濃度的錳離子孵育細(xì)胞24小時后，500μM，1000μM和15

7、0μM錳離子濃度對細(xì)胞有明顯的毒性效應(yīng)，細(xì)胞的生活率分別為對照組的82％±6.13，78％±5.28和66％±4.22(P<0.05)。當(dāng)以同樣的濃度處理細(xì)胞48小時后，各處理組的細(xì)胞活性都有明顯下降。實(shí)驗(yàn)選取500μM錳離子濃度來檢測細(xì)胞的凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在24小時的孵育后，細(xì)胞的凋亡百分比由4％±0.84上升到7％±1.16，經(jīng)過48小時的孵育，細(xì)胞的凋亡百分比上升到11％±0.91，而正常培養(yǎng)24小時和48小時后細(xì)胞的凋亡情況沒有

8、明顯的改變。而且在錳離子分別作用24小時和48小時后，細(xì)胞的壞死情況也都沒有明顯變化，說明錳離子作用48小時以內(nèi)主要促進(jìn)的是心肌細(xì)胞的凋亡過程。凋亡細(xì)胞可明顯觀察到DNA片斷化和核固縮兩個典型的核凋亡形態(tài)，說明錳離子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中DNA受到的嚴(yán)重?fù)p傷。Bcl-2、Bax和P53是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，尤其是P53是響應(yīng)DNA損傷而高表達(dá)的凋亡蛋白，它的升高還可以繼續(xù)調(diào)節(jié)許多凋亡蛋白基因的表達(dá)，為了確定這些調(diào)節(jié)蛋白是否參與了

9、錳離子誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，我們在50μM錳離子濃度下孵育48小時后對心肌細(xì)胞Bcl-2，Bax和P53 mRNAs表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl-2 mRNA的表達(dá)在錳離子處理后有明顯下降，而Bax和P53mRNAs的表達(dá)量卻表現(xiàn)出明顯的升高。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明錳離子對心肌細(xì)胞毒性作用可損傷心肌線粒體并促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，P53，Bcl-2和Bax凋亡蛋白都參與了心肌凋亡過程，P53蛋白表達(dá)的增加可能導(dǎo)致了Bcl-2表達(dá)降低和Bax表達(dá)

10、的上升。 本論文的研究主要發(fā)現(xiàn)有：1)心肌細(xì)胞L-型鈣通道和線粒體是錳毒性的作用靶點(diǎn)，錳離子可以引起L-型鈣通道組成蛋白分子水平的變化，在阻斷L-型鈣通道的同時又導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，造成細(xì)胞鈣超載。2)錳離子還可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽含量的減少，致使過氧化氫的過量積累，對線粒體膜造成傷害，引起線粒體膜電位的下降。3)線粒體脫氫酶的活性降低是錳作用下心肌細(xì)胞活性的下降的主要原因，并可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。為現(xiàn)有的關(guān)于錳的心肌毒性