Pso P27抗原參與銀屑病機(jī)制探索及清熱涼血解毒法干預(yù).pdf

1、目的：Pso P27抗原是一種在銀屑病患者鱗屑中提取的銀屑病相關(guān)抗原，由肥大細(xì)胞產(chǎn)生，在銀屑病皮損及外周血中以免疫復(fù)合物形式存在，與銀屑病病情密切相關(guān)，藥物治療后皮損區(qū)抗原表達(dá)可顯著下降，然而該抗原參與銀屑病發(fā)病的確切機(jī)制尚不明確。
　　清熱涼血解毒法治療銀屑病療效確切，多項(xiàng)臨床研究均支持了這一觀點(diǎn)。而且在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)它能夠有效降低Pso P27抗原在銀屑病患者皮損中的表達(dá)。因此，為了揭示清熱涼血解毒法治療銀屑病的分子生物

2、學(xué)基礎(chǔ)和科學(xué)內(nèi)涵，為銀屑病的臨床治療實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法，以探索Pso P27抗原誘發(fā)銀屑病的內(nèi)在機(jī)制，并且觀察清熱涼血解毒法體外干預(yù)效果。
　　內(nèi)容：(1)pso p27抗原對銀屑病相關(guān)免疫細(xì)胞T細(xì)胞、PBMC細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌的影響，及此兩種細(xì)胞上清液對Hacat細(xì)胞增殖的影響，以及清熱涼血解毒含藥血清對以上細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌的干預(yù)。
　　具體實(shí)驗(yàn)方法如下：培養(yǎng)銀屑病患者T細(xì)胞、PBMC細(xì)

3、胞及人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株Hacat，用pso p27抗原進(jìn)行干預(yù)，分別采用MTT、WST-1及WST-8的方法檢測不同時(shí)點(diǎn)三種細(xì)胞的增殖度，并采用ELISA檢測方法，檢測T細(xì)胞及PBMC細(xì)胞因子分泌，包括IL-1、TFN-α。
　　采用大鼠含藥血清制備的方法，制備清熱涼血解毒含藥血清(生地、紫草、土茯苓、白花蛇舌草、大青葉、赤芍、丹皮等)，用不同濃度梯度含藥血清干預(yù)T細(xì)胞、PBMC細(xì)胞及Hacat細(xì)胞，觀察以上三種細(xì)胞的增殖情況

4、(檢測方法同前)。
　　(2)清熱涼血解毒藥物有效單體對Hacat細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　選擇該方藥可能有效的四種單體：熊果酸(白花蛇舌草)、落新婦苷(土茯苓)、紫草素(紫草)及丹皮酚(牡丹皮)，以不同濃度干預(yù)Hacat細(xì)胞，以明確藥物單體對該細(xì)胞的干預(yù)作用。檢測指標(biāo)包括：細(xì)胞增殖(WST-8)、細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞儀技術(shù)及免疫熒光技術(shù)均采用AV/PI雙染法)，RT-PCR觀察該四種單體對Hacat細(xì)胞促凋亡基因

5、Bax及抑凋亡基因Bcl-xl的影響。
　　結(jié)果：(1)Pso P27抗原在體外并不能有效誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，同時(shí)對其細(xì)胞因子的分泌亦無明顯影響，但是它在一定程度上可以促進(jìn)PBMC細(xì)胞的體外增殖，誘導(dǎo)其TNF-α的分泌。同時(shí)，銀屑病患者PBMC上清液以及Pso p27干預(yù)后PBMC上清液均可以刺激Hacat細(xì)胞的體外增殖，且抗原干預(yù)后增殖效果更為明顯。而清熱涼血解毒含藥血清則能夠在一定程度上抑制T細(xì)胞、PBMC細(xì)胞以及Hacat細(xì)胞

6、的體外增殖，其抑制作用與含藥血清的濃度及劑量相關(guān)，只有當(dāng)血清濃度達(dá)到20％時(shí)，其抑制作用才較為明顯，且其中以大濃度及陽性對照組為最顯著。與此同時(shí)，我們連續(xù)5日觀察了含藥血清對Hacat細(xì)胞增殖干預(yù)的影響中發(fā)現(xiàn)，其抑制效果與作用時(shí)間之間關(guān)系并不十分明確。
　　(2)中藥單體對Hacat細(xì)胞的干預(yù)研究中，熊果酸、紫草素及丹皮酚均能夠有效抑制Hacat細(xì)胞的體外增殖，且抑制作用與藥物濃度密切相關(guān)，而落新婦苷則對Hacat細(xì)胞具有體外促增

7、殖作用。在對Hacat細(xì)胞周期分布的影響中，前三者均可以對Hacat細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯，然而阻滯時(shí)期并不相同，如熊果酸可以將Hacat細(xì)胞阻滯于G1/G0期，而紫草素及丹皮酚則將Hacat細(xì)胞阻滯于G2/M期。由于落新婦苷對Hacat細(xì)胞具有促增殖作用，因此其對Hacat細(xì)胞的周期影響并不能用周期阻滯表示。它可以在一定程度上減少細(xì)胞G2/M期的含量，促使細(xì)胞及早進(jìn)入G1/G0期。前三者還可以誘導(dǎo)Hacat細(xì)胞的凋亡，其凋亡率與正常對照組之

8、間具有顯著差異，而落新婦苷則可以抑制Hacat細(xì)胞的早期凋亡，其早期凋亡率與對照組比較具有顯著差異。在對Bcl-xl及Bax的干預(yù)作用中，四種單體干預(yù)效果均不同。熊果酸可以促進(jìn)Bcl-xl的含量的升高，并降低Bax的含量，而紫草素則具有雙抑制作用，丹皮酚則具有雙促進(jìn)作用，落新婦苷對它們的表達(dá)并無影響。
　　結(jié)論：
　　(1)Pso p27是銀屑病相關(guān)抗原之一，多項(xiàng)研究表明它參與銀屑病發(fā)病，然而具體機(jī)制尚不明確。
　　我

9、們認(rèn)為它與T細(xì)胞的活化及相關(guān)細(xì)胞因子的釋放密切相關(guān)，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明它并不能有效誘導(dǎo)T細(xì)胞的體外增殖及細(xì)胞因子的釋放，但卻可以對PBMC細(xì)胞產(chǎn)生促增殖及促細(xì)胞因子釋放的作用，同時(shí)還可以間接引起Hacat細(xì)胞的體外增殖。因此，我們認(rèn)為Pso P27參與銀屑病的發(fā)病與PBMC細(xì)胞密切相關(guān)，活化后的PBMC細(xì)胞可以釋放相關(guān)細(xì)胞因子等，誘導(dǎo)銀屑病的發(fā)病。然而，PBMC為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等組成的一個(gè)多細(xì)胞群，Pso P27抗原確切作用的靶細(xì)胞尚

10、不完全明確，仍需要我們進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)，加以發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證。
　　(2)清熱涼血解毒含藥血清對銀屑病發(fā)病相關(guān)細(xì)胞的干預(yù)存在不穩(wěn)定性
　　清熱涼血解毒含藥血清對銀屑病發(fā)病的多種細(xì)胞均具有體外抑制增殖的作用，其生物效應(yīng)的發(fā)揮與藥物濃度呈依賴關(guān)系。然而，由于中藥含藥血清的制備工藝較為繁瑣，涉及環(huán)節(jié)較多，穩(wěn)定性較差，因此我們應(yīng)更加關(guān)注如何改進(jìn)此中藥藥理學(xué)分析方法，使其能夠更好地為中藥復(fù)方的藥理及藥效研究服務(wù)。
　　此外，中藥復(fù)方干預(yù)

11、疾病多是多通路多靶位的，抑制相關(guān)細(xì)胞的體外增殖，僅僅是其作用機(jī)制的一個(gè)側(cè)面，我們還需要全面認(rèn)識清熱涼血解毒含藥血清療效的發(fā)揮的作用機(jī)制。
　　(3)清熱涼血解毒中藥單體對Hacat細(xì)胞的增殖與凋亡作用各具特色
　　在本研究中我們檢測了中藥單體熊果酸、紫草素、丹皮酚及落新婦苷體外干預(yù)Hacat細(xì)胞，對其體外增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡以及凋亡基因Bcl-xl與Bax表達(dá)的影響。
　　單體的藥物作用既存在相同點(diǎn)，又各有特色。其

12、中熊果酸、紫草素以及丹皮酚的作用，與白花蛇舌草、紫草以及丹皮在銀屑病治療中的作用效果基本保持一致，在體外實(shí)驗(yàn)中仍能夠抑制Hacat細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)其凋亡，但是對于凋亡基因Bax、Bcl的影響各不相同。
　　而落新婦苷在卻能夠體外促進(jìn)Hacat細(xì)胞的增殖，并對其早期凋亡具有一定抑制能力，而對凋亡基因Bcl-xl及Bax的表達(dá)無影響。這與土茯苓治療銀屑病的臨床療效存在差異。我們考慮該單體可能并不是土茯苓治療銀屑病的有效單體，或者落